Проточная цитометрия лимфопролиферативные заболевания

Заболеваемость злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной ткани (гемобластозами) с каждым годом увеличивается во всем мире.

По данным канцер-регистра Республики Беларуси, за 1999-2008 гг. стандартизованные показатели заболеваемости лейкозами и лимфомами составляли 20,1 на 100 000 населения. Неуклонно увеличиваются показатели смертности больных с лейкозами и злокачественными лимфомами.

Уровень 5-летней выживаемости больных с гемобластозами остается по-прежнему низким.

Под термином "лимфома" понимают большое количество различных видов заболевания, существенно отличающихся друг от друга по своим проявлениям и подходам к их лечению. Все лимфомы разделяют на 2 большие группы: лимфома Ходжкина (ЛХ) и неходжкинские лимфомы (НХЛ). Решение о принадлежности лимфомы к группе неходжкинских лимфом или к болезни Ходжкина принимается после гистологического исследования образца биопсированной ткани. Если при микроскопическом исследовании находят специфические для болезни Ходжкина клетки Березовского-Штернберга-Рида, то ставят диагноз болезни Ходжкина. Если эти специфические клетки не находят, то лимфому относят к группе неходжкинских. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) — гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и по прогнозу. Вероятность развития неходжкинских лимфом значительно повышается с возрастом — почти в 20 раз после 80 лет. По темпу прироста заболеваемость НХЛ опережает ЛХ. Средний возраст пациентов с НХЛ 50-60 лет.

За 170 лет изучения злокачественных НХЛ, в отличие от ЛХ, претерпели множество терминологических изменений: лимфосаркома, злокачественная лимфома, лимфобластома, ретикулосаркома, гематосаркома и др., что свидетельствует о клинико-морфологической сложности данной группы заболеваний.

Этиология неходжкинских лимфом недостаточно ясна. Установлена роль вируса Эпштейна–Барр в возникновении одной из редких форм — лимфомы Беркитта. Риск развития НХЛ значительно повышается при ВИЧ-инфекции, первичных и вторичных иммунодефицитах. В настоящее время установлено, что НХЛ — злокачественная опухоль из клеток иммунной системы клонального характера. Изучается роль человеческого Т-клеточного лимфотропного вируса I-го типа и вируса герпеса. Наследственные факторы в возникновении НХЛ не имеют существенного значения. Отмечено увеличение заболеваемости НХЛ при длительном контакте с пестицидами. Лимфома Ходжкина - название введено Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) в 2001г., - это опухолевое заболевание лимфатической системы. Впервые описано Томасом Ходжкиным в 1832 г. Хотя риск развития лимфомы Ходжкина достаточно низок – 0,24% среди мужчин и 0,2% среди женщин, около 15% всех случаев приходится на молодой возраст – от 15 до 24 лет. Лимфома Ходжкина имеет уникальную бимодальную (иногда трёхмодальную) возрастную кривую - заболеваемость имеет два пика - первый приходится на возраст 15-40 лет, а второй постепенно нарастает после 50 лет.

Хронические лимфопролиферативные заболевания (ХЛПЗ) объединяют целую группу биологически различных опухолей, возникающих в результате накопления и/или пролиферации клональных морфологически зрелых лимфоцитов. Сама природа этих клеток делит заболевания на две большие группы: Т-клеточные и В-клеточные хронические лимфопролиферативные заболевания, внутри которых на основании клинических проявлений и опухолевого происхождения выделяют:

  • собственно лейкозы, всегда протекающие с вовлечением периферической крови;
  • лейкемическая стадия (лейкемизация) лимфомы, при которой источником заболевания является периферическая лимфоидная ткань, но клинические проявления, ответ на ХТ и прогноз соответствуют лейкозу;
  • лимфоматозные формы, при которых кровь крайне редко вовлекается в патологический процесс.

Иммунофенотипическая диагностика ХЛПЗ по фенотипическому профилю клеток периферической крови возможна только в двух ситуациях:

  • при выходе в системный кровоток опухолевых (трансформированных) лимфоцитов зрелоклеточной морфологии (пролимфоцитарный, лимфоцитарный, волосатоклеточный лейкозы);
  • при лейкемизации лимфомы, когда происходит экспансия опухолевых клеток в периферическую кровь и костный мозг (фолликулярная лимфома, лимфома клеток маргинальной зоны, лимфомы скоплений лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми, лимфома селезенки с отросчатыми (ворсинчатыми) лимфоцитами, лимфома кожи.

Проведение диагностического ИФТ оправдано при выявлении в периферической крови абсолютного и относительного лимфоцитоза. Пороговый уровень лимфоцитоза, при котором считается необходимым проводить диагностическое ИФТ за последние годы снизился с 10х10 9 /л [74] до 5х10 9 /л.

С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие гибридомной технологии позволило получать моноклональные антитела любой специфичности, стало возможным нарастающее по сложности и объему информации иммунофенотипирование.

Проточная цитометрия (ПЦ) является интегральным инструментом изучения различных биологических систем с помощью регистрации флюоресценции и использования флюоресцентных красителей, способных связываться с различными компонентами клетки.

В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и раскладывают на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме. Величины, измеренные фотоумножителем, отображаются на гистограммах. Современные проточные цитофлуориметры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10°), которое еще называют прямым светорассеянием (forward scattering или FSC); рассеяние света на угол 90°, т.н. боковое светорассеяние (side scattering или SSC]; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн. Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.

Традиционно концентрация клеток определяется путем разделения пробы на две части и сравнение результатов анализа иммунофенотипирования, выполненного на проточном цитометре с результатами подсчета клеток на гематологическом анализаторе. Такая процедура приводит к дополнительным затратам времени, средств и мощностей лабораторного оборудования. В настоящее время на рынке имеются наборы калибровочных частиц для определения концентрации клеток непосредственно на проточном цитометре, однако их использование также связано с дополнительными затратами. Проточные цитометры являются полностью открытыми системами, что не ограничивает пользователя в выборе реагентов.

При анализе клеток, маркированных двумя, тремя или четырьмя антителами, коньюктированными с различными цветовыми метками, необходимо проводить компенсацию сигналов с флуоресцентных каналов проточного цитометра из-за перекрытия спектров эмиссии используемых красителей.

Проточная цитометрия позволяет определить долю клеток, находящихся в S-фазе и оценить степень пролиферации. С помощью ДНК-гистограмм возможно четко разделить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/M-фазах клеточною чикла. Совокупность информации о содержании ДНК, маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, имеет важное значение в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний крови и солидных опухолей.

Диагностика лейкозов, лимфом в настоящее время одна из наиболее передовых областей использования проточной цитометрии. Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга обеспечивает ключевой информацией для качественной диагностики и оценки прогноза заболевания.

Трансплантация костного мозга (ТКМ) при лимфомах и лейкозах предполагает перенос стволовых мультипотентных клеток, ответственных за восстановление нормального гемо- и лимфопоэза, в противоположность гемотрансфузиям, которые дают временный эффект. Кроветворные клетки для ТКМ могут быть получены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Процедура ТКМ более не является экспериментальным методом, а составляет важный компонент в лечении онкологических и наследственных заболеваний. Рецептор CD34 используется как маркер полипотентных кроветворных стволовых клеток. Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток при помощи проточной цитометрии является золотым стандартом в оценке количества кроветворных клеток.

Таким образом, проточная цитометрия имеет достаточно широкие возможности для решения различных диагностических и исследовательских задач, делая лабораторное исследование технологичным, точным и своевременным.

Широкие возможности ее применения связаны с тем, что интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству контролируемого вещества в клетке, однако при определенных условиях могут быть зарегистрированы очень малые количества флюорохрома, в том числе меньше 1000 молекул на клетку. Некоторые флюоресцентные красители могут менять параметры флюоресценции внутри живых клеток и превращаться из нефлюоресцирующих во флюоресцирующие под воздействием определенных ферментов, изменять спектр флюоресценции под действием ионов кальция, их можно применять при конструировании молекулярных зондов.

Возможности ИФТ в прогнозировании течения и исхода онкогематологических заболеваний во многом определяются адекватным набором антител для первичной диагностики.

Развитие технологий в области мультипараметрического анализа, гейтирования по CD45, автоматизированного анализа кластеров и стандартизации аппаратуры достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток. Выявление молекул, тем или иным образом интегрированных с клеточной мембраной, является только одной из сфер применения ПЦ, но именно она имеет максимальное диагностическое значение.

Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга. Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах.

Виды биологического материала, направляемого на тестирование для выявления лейкоза/лимфомы и определения их природы, достаточно разнообразны: периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, взвесь клеток лимфатического узла, ликвор, плевральная жидкость.

Мультипараметрический анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца, время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым путь от получения биологического материала до клинического результата – иммунофенотипического диагноза. Проточная цитометрия предоставляет три типа данных:

  • необработанные данные интенсивности флюоресценций в формате, определяемым программным обеспечением прибора;
  • относительное содержание (%) различных клеточных популяций по оценке врача, проводящего анализ биологического материала;
  • информация по единичным маркерам, имеющим принципиальное значение для клиники (например, CD34 + при исследованиях в области гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)).

Последующая экспертная оценка всей совокупности данных, ведущая к установлению диагноза является дополнительным источником вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных.

Мультипараметрические возможности оценки клеток стали использовать для выявления фенотипических аберраций лейкозных клеток с максимальной вероятностью специфических генетических поломок для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика. Известно, что среди пациентов с идентичным, в том числе нормальным, кариотипом или генетическими аберрациями прогрессия заболевания различна и не всегда предсказуема, что требует поиска дополнительных критериев информации, которыми могут оказаться данные ИФТ. При невозможности получить метафазные пластинки выявление хромосомных аберраций может быть осуществлено с помощью молекулярных проб и определения профиля экспрессии генов в злокачественных клетках. Немногочисленные работы применения микроэррей-технологии при острых лимфобластных лейкозах показали перспективность этого направления при поиске новых прогностических признаков генетических нарушений и прогноза заболевания. К сожалению, молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где осуществляются, получение информации значительно дистанцировано во времени от получения биологического материала. С клинической точки зрения, это, скорее, подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его.

Для проведения иммунофенотипической диагностики лейкозов и лимфом необходимо выделить клетки, являющиеся субстратом заболевания. До появления методических возможностей работы с цельной кровью (костным мозгом) при диагностике гемобластозов только использование градиентного центрифугирования создавало возможность анализа трансформированных клеток, патологических лимфоцитов и бластов. За такое увеличение относительного содержания опухолевых клеток приходилось платить потерей возможности оценить клеточный состав образца в целом. Поэтому, если еще в середине 90-х годов ХХ века выделение мононуклеаров на градиенте плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки, то позднее пришли к однозначному предпочтению лизиса при работе с образцами онкогематологических пациентов.

Для определения возможности проведения ИФТ необходима информация о количестве лейкозных бластов в образце, так как при их низком содержании (менее 20%) фенотипический профиль бластной популяции может быть оценен неправильно. Принято считать, что относительное содержание бластов указано в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направляемый на ИФТ. Однако на практике нередко материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Кроме того, возможное разведение костного мозга периферической кровью может серьезно влиять на конечный результат исследования. Следствием этого оказывается необходимость вносить специфические антитела в избытке, а не из расчета на количество клеток. Для определения уровня бластоза при ПЦ необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и сдвоенных клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце и особенно часто выявляются при хронических лимфопролиферативных заболеваниях.

Основной задачей ИФТ является получение информации, которая позволяет установить факт наличия гемобластоза и его иммунологический вариант, а последующая их интерпретация предполагает интегральный анализ ИФТ и других клинических и лабораторных данных.

Литература

Комплекс методов проточной цитометрии позволяет измерять физические и химические параметры отдельных клеток или частиц. Он основан на регистрации флуоресценции и светорассеяния от отдельных клеток или частиц, проходящих через лазерный луч в струе жидкости. Методы проточной цитометрии чаще всего применяется при исследовании периферической крови человека, в частности лейкоцитов. Также можно исследовать диссоциированные клетки любых тканей, дрожжевые клетки, бактериальные клетки, микропланктон, флуоресцентные микросферы с зондами.

Комплекс методов проточной цитометрии включает:

  1. 1. Анализ клеток и частиц:
  • - идентификация отдельных классов, подклассов, популяций, субпопуляций путем измерения их поверхностных и/или внутриклеточных маркеров;
  • - оценка функционального состояния клеток (митохондриальный потенциал, внутриклеточный кальций, pH) с использованием специальных ратиометрических красителей (FDA, DiOC1, JC -1 и др.);
  • - оценка функционального состояния клеток с помощью специфических антител к фосфорилированным и не-фосфорилированным формам изучаемых белков;
  • - многопараметрический (многоцветный) анализ проб;
  • - анализ параметров клеточного цикла и содержания ДНК в живых и фиксированных клетках;
  • - изучение кинетических параметров клеточных процессов (повреждение клеточных мембран, ферментативная активность);
  • - исследование механизмов и стадий апоптоза с использованием разнообразных маркеров и зондов;
  • - изучение фагоцитоза, в том числе в нейтрофилах крови и макрофагах;
  • - исследование чувствительности клеток к цитостатикам путем определения уровня экспрессии белков (P-gp и др.);
  • - молекулярно-генетические исследования (изучение отдельных хромосом и экспрессии генов);
  • - проточное кариотипирование хромосом с использованием флуоресцентных зондов.
  1. 2. Сортировку клеток и частиц:
  • - сортировка до 4 фракций в соответствии с проведенным гейтированием;
  • - сортировка единичных клеток в культуральные и/или ПЦР-планшеты.

Цитометрический анализ клеточного цикла

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода:

Анализ клеточного цикла – один из методов изучения пролиферативной активности клеток. С помощью метода исследуются фазы клеточного цикла: оценивается распределение клеток по G1/G0-, S- и G2/M-фазам клеточного цикла путем определения относительного содержания ДНК в клетках при помощи ДНК-связывающих флуоресцентных красителей, таких как PI (йодистый пропидий), 7-AAD (7-аминоактиномицин), DAPI (4’6’-diamidino-2-phenylindole (DAPI)), Hoechst, SybrGreen и др. С помощью данного метода можно анализировать только клеточные суспензии, что является одним из ограничительных факторов метода.

Метод используется как в научных, так и в клинических исследованиях, например,:

  • - выявление высоко пролиферирующих популяций клеток;
  • - выявление анеуплоидных популяций клеток;
  • - анализ эффектов лекарственных препаратов.

Вариации метода:

- использование различных красителей ДНК:

  • 1). Красители, проникающие через плазматическую мембрану и мембрану ядра, предназначенные для окрашивания живых клекток.
  • 2). Красители, не проникающие через мембраны ядра, требующие предварительной обработки клетки: фиксации и/или пермеабилизации;

- в случае необходимости фиксации и/или пермеабилизации использование разных агентов:

  • 1). Использование спиртов (этанола) – одновременно и фиксирующего, и пермеабилизирующего агента. Использование спиртов обеспечивает легкий доступ красителя в ядро, а также хорошие характеристики анализируемого сигнала – низкий коэффициэнт вариации (CV). Однако, часто использование спиртов несовместимо с использованием флуоресцентных красителей. Фиксированные спиртом клетки стабильны в течение нескольких недель при температуре 4°C.
  • 2). Использование альдегидов (параформальдегида) – фиксирующего агента. Использование альдегидов позволяет одновременную (синхронную) детекцию различных флуорохромов и мембран-связанных протеинов. Однако, использование альдегидов приводит к ухудшению характеристик анализируемых сигналов (высокий коэффициент вариации), а также в большинстве случаев альдегиды только фиксируют, но не пермеабилизируют мембраны, что приходит к необходимости применять дополнительные пермеабилизирующие агенты, такие как Triton X-100 (0.1%) и др. Фиксированные альдегидом клетки стабильны в течение двух-трех дней при температуре 4°C.

Протокол анализа клеточного цикла с помощью проточной цитометрии путем окрашивания ДНК йодистым пропидием (PI)

  • 70% этонол,
  • йодистый пропидий (исходный раствор 50 мкг/мл),
  • рибонуклеаза I (исходных раствор 100 мг/мл).

  • 1). Собрать клетки в пробирку и отмыть несколько раз в PBS.
  • 2). Провести фиксацию клеток в холодном 70% этаноле: Осадить клетки; удалить буфер; перемешивая клетки на вортекте, медленно добавлять этанол. Таким образом происходит фиксация всех клеток и предотвращается образование слипшихся масс. Оставить фиксироваться клетки в этаноле на 30 мин при 4°C.
  • 3). Отмыть клетки от этанола в PBS (2 раза): отцентрифугировать клетки на скорости 850 g, осторожно слить супернатант, избегая потери клеток, особенно после первой отмывки от этанола. Оставить часть клеток в качестве отрицательного контроля (неокрашенные клетки).
  • 4). Обработать клетки рибонуклеазой I: добавить 50 мкл исходного раствора рибонуклеазы I (100 мг/мл). Это обеспечит связывание только ДНК с красителем, но не РНК.
  • 5). Добавить 200 млк исходного раствора PI (100 мг/мл).

- Анализ образца на проточной цитрфлуориметре:

  • 1) Настроить прибор с помощью неокрашенных клеток.
  • 2) Найти и гейтировать исследуемый образец на гистограмме FSC-A (прямое светорассеяние) против SSC-A (боковое светорассеяния).
  • 3) Отделить синглеты на гистограмме SSC-H (высота сигнала бокового светорассеяния) против SSC-W (ширина сигнала бокового светорассеяния).
  • 4) Провести анализ фаз клеточного цикла на гистограммах FSC-A против PI; PI-W (ширина сигнала флуоресценции PI) против PI-A (площадь) сигнала флуоресценции PI); PI против количества клеток.

  • M.G. Ormerod, B. Tribukait, Walter Giaretti. Consensus report of the task force on standardisation of DNA flow cytometry in clinical pathology// Analytical Cellular Pathology. (Hindawi Publishing Corporation) 1998, v.17, № 2, p.103-110.
  • Кудрявцев И.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в экспериментальной биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2012, 192 с.

Цитометрический анализ апоптотической (программируемой) клеточной гибели: AnnexinV-FITC/PI

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода:

Цитометрический анализ апоптотической (программируемой) клеточной гибели с помощью AnnexinV-FITC/PI – один из комплекса методов исследования апоптоза с помощью проточной цитометрии. AnnexinV-FITC/PI – самый распространенный и легко воспроизводимый тест для исследования апоптоза клетки, который, однако, не заменяет другие тесты, и для получения полноценных данных применяется в комплексе с ними.

Апоптотическая гибель клетки состоит из 4 основных стадий: 1) Начальная стадия – индукция (внешний или внутрений пути) – обратимая стадия. 2) Первые видимые события: митохондриальная "катастрофа" – пермеабилизация наружной мембраны и сброс потенциала; нарушение калий-натриевого баланса и съеживание клетки. 3) Промежуточные события: активация каспаз и экстернализация фосфатидилсерина; нарушение проницаемости плазматической мембраны. 4) Поздние события: деградация ДНК, конденсация и затем фрагментация ядра, полная пермеабилизация плазматической мембраны; распад клетки. С помощью описываемого метода (AnnexinV-FITC/PI) можно разделить клетки на живые клетки (влючает живые клетки и клетки на первой и второй стадиях апоптоза), апоптотичесчкие клетки (третья и частично четвертая стадии апоптоза) и вторичные некротические клетки. Метод основан на:

  • - регистрации изменений архитектуры наружной плазматической мембраны клетки на третьей стадии апоптоза. В нормальных живых клетках фосфолипид фосфатидилсерин находится во внутреннем слое мембраны клетки, в то время как в наружном слое мембраны он представлен в минимальных количествах. На третьей стадии апоптоза фосфатидилсерин экстернализуется из внутреннего слоя мембраны в наружный. В присутствии ионов Ca 2+ AnnexinV специфично связывается с фосфатидилсероном, находящемся в наружном слое мембраны, и конъюгированный с флуоресцентной меткой (FITC) он позволяет определить начало 3 стадии апоптоза;
  • - неспособности PI входить в живые клетки, а также в клетки с нетронутой наружной плазматической мембраной. PI начинает входить в клетки только в конце третьей стадии апоптоза после того, как целостность наружной мембраны нарушается. Таким образом, используя конъюгат AnnexinV-FITC в комбинации с ДНК красителем PI, можно разделить исследуемый образец на 4 популяции:
  • популяция условно живых клеток: негативный сигнал от обоих красителей (FITC-/PI-);
  • популяция клеток на ранней/ средней стадии апоптоза: позитивный сигнал FITC и негативный сигнал PI (FITC+/PI-);
  • популяция клеток на поздней стадии апоптоза / условно некротические клетки: позитивный сигнал FITC и позитивный сигнал PI (FITC+/PI+);
  • некротические клетки / остатки клеток: негативный сигнал FITC и позитивный сигнал PI (FITC-/PI+).

Ограничения анализа апоптотической (программируемой) клеточной гибели с помощью AnnexinV-FITC/PI: исследование апоптоза только на живых (нефиксированных) клетках в суспензии.

Протокол цитофлуориметрического анализа апоптоза клеток с помощью AnnexinV-FITC/PI метода:

  • связывающий буфер (10 mM HEPES/NaОН pH7.4, 140 mM NaCl, 2.5 mM CaCl2),
  • FITC-Annexin V,
  • PI (исходный водный раствор 400 мг/мл йодистого пропидия, 4°C).

  • 1). Приготовить суспензию клеток с концентрацией 10 6 /мл, отмыть в PBS 2 раза.
  • 2). Осадить клетки центрифугированием, удалить буфер, ресуспензировать клетки в связывающем буфере.
  • 3). Добавить конъюгат AnnexinV-FITC в конечной концентрации 1мг/мл клеточной суспенции. Инкубировать 10 мин. в темноте при комнатной температуре.
  • 4). Добавить PI в конечной концентрации 2 мг/мл клеточной суспенции. Продолжить инкубацию еще 5 мин.

Для корректного анализа также необходимо приготовить контроли:

  • - отрицательный контроль для настройки прибора (неокрашенные клетки);
  • - клетки, окрашенные только конъюгатом AnnexinV-FITC, и клетки, окрашенные только PI, для настройки компенсации;
  • - в качестве положительного контроля можно провести окраску клеток без использования Ca 2+ -содержащего буфера.

- Анализ окрашенных клеток на проточной цитрфлуориметре:

1). Настроить прибор с помощью неокрашенных клеток, а также остальных контролей.

2). Найти и гейтировать исследуемый образец на гистограмме FSC-A (прямое светорассеяние) против SSC-A (боковое светорассеяния).

3). Отделить синглеты на гистограмме SSC-H (высота сигнала бокового светорассеяния) против SSC-W (ширина сигнала бокового светорассеяния).

4). На гистограмме FITC-A (площадь сигнала флуоресценции FITC) против PI-A (площадь сигнала флуоресценции PI) разделить клетки на 4 популяции и провести дальней анализ выделенных популяций (определить процентное содержание каждой популяции). При этом необходимо помнить, что в процессе пробоподготовки исследуемые клетки могут также уходить в апоптоз, индуцированный сторонними воздействиями. Поэтому после первичной (экспериментальной) индукции апоптоза необходимо как можно скорее провести анализ клеток на проточном цитофлуориметре. Также необходимо учитывать, что начальные стадии апоптоза – обратимые, поэтому цитофлуориметрический анализ апоптоза клеток с помощью AnnexinV-FITC/PI метода необходимо повторять несколько раз для получения достоверных воспроизводимых результатов.

  1. I. Vermes, C. Haanen, C. Reutelingsperger. Flow cytometry of apoptotic cell death// Journal of Immunological Methods. V. 243, Issues 1-2, 2000, p. 167-190.
  2. I. Vermes, C. Haanen, H. Steffens-Nakken, C. Reutelingsperger. A novel assay for apoptosis. Flow cytometic detection of phosphatidylserine expression on early apoptotic cells using fluorescein labeled Annexin V// J. Immunol. Methods, 184 (1995), p. 39.
  3. Кудрявцев И.В., Хайдуков С.В., Зурочка А.В., Черешнев В.А. Проточная цитометрия в экспериментальной биологии. Екатеринбург: РИО УрО РАН, 2012, 192 с.

Иммунофенотипирование методом проточной цитометрии

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода:

Иммунофенотипирование – анализ гетерогенной популяции клеток с целью выявления наличия и соотношения популяций интереса путем анализа поверхностных и внутриклеточных антигенов (маркеров), экспрессируемых клетками. Выявление и анализ антигенов производится с помощью конъюгированных с флуорохромами антител путем детекции флуоресцентного сигнала проточным цитофлуориметром. В качестве антигенов чаще всего используются функциональные протеины мембран, вовлеченные в клеточную коммуникацию, адгезию и метаболизм.

В научных и клинических исследованиях применяется, прежде всего, фенотипирование клеток крови и костного мозга с помощью мультипараметрического (многоцветного) анализа поверхностных CD маркеров. Данный метод позволяет разделить клетки на популяции клеток с различными фенотипами (как известными в литературе, так и новыми, еще неисследованными ранее), анализируя интенсивность сигналов исследуемых флуоресцентных маркеров. Проточный цитофлуориметр с тремя лазерами в конфигурации 3-6-3 полосных фильтра позволяет одновременно регистрировать до 11 флуоресцентных маркеров.

  • - анализ поверхностных и/или внутриклеточных маркеров;
  • - анализ живых / фиксированных клеток;
  • - использование разных протоколов окрашивания (с помощью конъюгатов первичных антител / с помощью конъюгатов вторичных антител).

Общий протокол для иммунофенотипирования с использованием конъюгатов первичных антител

  • 1). Собрать, отмыть клетки и развести их в концентрации 1-5x10 6 клеток/мл в холодном буфере PBS (с добавлением 10% FCS, 1% азида натрия).
  • Рекомендуется работать с клетками при температуре 4°C, используя охлажденные реактивы и в присутствии азида натрия для предотвращения модуляции и интернализации поверхностных антигенов.
  • 2). Добавить 0.1-10 мг/мл первичных антител, конъюгированных с флуорохромами. При необходимости разводить антитела можно в 3% растворе BSA/PBS. Также можно добавить йодид пропидия для исключения мертвых клеток.
  • 3). Инкубировать антитела как минимум 30 мин при комнатной температуре или при температуре 4°C (в зависимости от используемых антител).
  • 4). Отмыть клетки 3 раза с помощью центрифугирования на 400 g 5 мин. и развести их в 500-1000 мкл холодного PBS (с добавлением 10% FCS, 1% азида натрия). Держать клетки необходимо в темноте на льду. Провести анализ клеток на проточной цитометре рекомендуется как можно быстрее после завершения окраски. Если требуется время между окрашиванием и анализом рекомендуется произвести фиксацию клеток после пункта 3.

Для корректного анализа образца необходимо приготовить также контроли: отрицательный контроль (неокрашенные клетки), изотипический контроль (клетки, окрашенные каждым флуорохромом отдельно (при окраске образца более чем одним красителем), для настройки компенсации).

- Анализ окрашенных клеток на проточной цитрфлуориметре:

  • 1). Настроить прибор, используя неокрашенные клетки и необходимые контроли.
  • 2). Найти и гейтировать исследуемый образец на гистограмме FSC-A (прямое светорассеяние) против SSC-A (боковое светорассеяния).
  • 3). Отделить синглеты на гистограмме SSC-H (высота сигнала бокового светорассеяния) против SSC-W (ширина сигнала бокового светорассеяния).
  • 4). Разделить клетки интереса на отдельные популяции и проанализировать их в соответствии с интенсивностью флуоресценции исследуемых маркеров на соответствующих гистограммах FL1/FL2 и т.д.

  • 1. Stewart CC, Nicholson JKA, editors. Immunophenotyping. New York: Wiley-Liss; 2000.
  • 2. Robinson JP, Darzynkiewicz Z, Hyun W, Orfao A, Rabinovitch P, editors. Current protocols in cytometry. New York: John Wiley & Sons; 2004.
  • 3. Gutensohn K, Sonneborn HH, Kuhnl P, editors. Aspects of the flow cytometric analysis of red blood cells. Heidelberg: Clin Lab Publications; 1997.

Сортировка единичных клеток (single cell sorting)

Используемое оборудование РЦ:

  • проточный цитофлуориметр-сортировщик клеток BD FACSAriaIII;
  • рутинное оборудование.

Описание метода

Данный метод предоставляет возможность рассортировать клетки по 1 шт. в каждую лунку культуральных и ПЦР-планшетов в соответствии в проведенным гейтированием по исследуемым клеточным маркерам. Сортировка единичных клеток применяется, прежде всего, для последующего культивирования (получения чистых клеточных линий от одной клетки) или для последующего генетического анализа (проведения ПЦР одной клетки). Сортировка единичных клеток отличается от стандартной сортировки особой настройкой проточного цитофлуориметра-сортировщика клеток таким образом.

  • Необходимо сортировать в оптимальных биологических условиях:

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.