Гетерогенность рака молочной железы

Полный текст:

  • Аннотация
  • Об авторах
  • Список литературы
  • Cited By

профессор, д. м.н., зав.кафедрой патологической анатомии,

4. O’Neill F1, Madden SF, Clynes M et all. A gene expression profile indicative of early stage HER2 targeted therapy response. Mol Cancer. 2013 Jul 1;12:69.

5. Abramovitz M, Barwick BG, Willis S et all. Molecular characterisation of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tumour specimens using a custom 512-gene breast cancer bead array-based platform. Br J Cancer. 2011 Nov 8;105 (10):1574–81.

6. Strehl JD, Wachter DL, Fasching PA et all. Invasive Breast Cancer: Recognition of Molecular Subtypes. Breast Care (Basel). 2011;6 (4):258–264.

7. E. Senkus, S. Kyriakides, F. Penault-Llorca et all., on behalf of the ESMO Guidelines Working Group* Primary breast cancer: ESMO Clinical Practice Guidelines for diagnosis, treatment and follow-up†Annals of Oncology 0: 1–17, 2013.

10. Pracella D, Bonin S, Barbazza R et all. Are breast cancer molecular classes predictive of survival in patients with long follow-up? Dis Markers. 2013;35 (6):595–605.

11. Prat A, Cheang MC, Mart n M et all. Prognostic significance of progesterone receptor-positive tumor cells within immunohistochemically definedluminal A breast cancer. J Clin Oncol. 2013 Jan 10;31 (2):203–9.

12. Kim HS, Park I, Cho HJ and all. Analysis of the potent prognostic factors in luminal-type breast cancer. J Breast Cancer. 2012 Dec;15 (4): 401–6.

13. Parise CA, Bauer KR, Brown MM et all. Breast cancer subtypes as defined by the estrogen receptor (ER), progesterone receptor (PR), and the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) among women with invasive breast cancer in California, 1999–2004. Breast J. 2009 Nov-Dec;15 (6):593–602.

14. Cheang MC, Chia SK, Voduc D et all. Ki67 index, HER2 status, and prognosis of patients with luminal B breast cancer. J Natl Cancer Inst. 2009 May 20;101 (10):736–50.

15. Wang Y, Yin Q, Yu Q et all.. A retrospective study of breast cancer subtypes: the risk of relapse and the relations with treatments. Breast Cancer Res Treat. 2011 Nov;130 (2):489–98.

16. Zhang HM, Zhang BN, Xuan LX, Zhao P. Clinical characteristics and survival in the operable breast cancer patients with different molecular subtypes. Zhonghua Zhong Liu Za Zhi. 2009 Jun; 31 (6):447–51.

17. Najafi B, Anvari S, Roshan ZA. Disease free survival among molecular subtypes of early stage breast cancer between 2001 and 2010 in Iran. Asian Pac J Cancer Prev. 2013;14 (10):5811–6.

18. Nofech-Mozes S, Trudeau M, Kahn HK et all. Patterns of recurrence in the basal and non-basal subtypes of triple-negative breast cancers. Breast Cancer Res Treat. 2009;118:131–137.

19. Elsamany S, Abdullah S. Triple-negative breast cancer: future prospects in diagnosis and management. Med Oncol. 2014 Feb;31 (2):834.

20. Bauer KR, Brown M, Cress RD et all. Descriptive analysis of estrogen receptor (ER) -negative, progesterone receptor (PR) -negative, and HER2-negative invasive breast cancer, the so-called triple-negative phenotype: a population-based study from the California Cancer Registry. Cancer. 2007;109:1721–1728.

21. Lips EH, Mulder L, Oonk et all.Triple-negative breast cancer: BRCAness and concordance of clinical features with BRCA1-mutation carriers. Br J Cancer. 2013 May 28;108 (10):2172–7.

22. Dent R, Trudeau M, Pritchard KI et all. Triple-negative breast cancer: clinical features and patterns of recurrence. Clin Cancer Res. 2007;13:4429–4434

23. Foulkes WD, Brunet J-B, Stefansson IM et all. The prognostic implication of the basal-like (cyclin E high/ p27low/p53+/glomeruloid-microvascular-proliferation+) phenotype of BRCA1-related breast cancer. Cancer Res. 2004;64:830–835.

24. Slamon DJ, Clark GM, Wong SG et all. Human breast cancer: correlation of relapse and survival with amplification of the HER-2/neu oncogene. Science. 1987 Jan 9;235 (4785):177–82.

25. Zurawska U, Baribeau DA, Giilck S et all. Outcomes of HER2-positive early-stage breast cancer in the trastuzumab era: a population-based study of Canadian patients. Curr Oncol. 2013 Dec;20 (6): e539–45.

26. Slamon D, Eiermann W, Robert N, et all. Adjuvant trastuzumab in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2011; 365:12731283.

27. Perez EA, Romond EH, Suman VJ and all. Four-year follow-up of trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable human epidermal growth factor receptor 2-positive breast cancer: joint analysis of data from NCCTG N9831 and NSABP B-31. J Clin Oncol. 2011 Sep 1;29 (25):3366–73.

28. Piccart-Gebhart MJ, Procter M, Leyland- Jones B, et all. Trastuzumab after adjuvant chemotherapy in HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005;353:1659–72.

29. Romond EH, Perez EA, Bryant J, et all. Trastuzumab plus adjuvant chemotherapy for operable HER2-positive breast cancer. N Engl J Med 2005;353:1673–84.

30. Nagtegaal ID, Allgood PC., Duffy SW et all. Prognosis and Pathology of Screen-Detected Carcinomas How Different Are They? J Cancer. 2011 Apr; 1360–8.

31. Coldman A, Phillips N, Wilson C et all. Pan-canadian study of mammography screening and mortality from breast cancer. J Natl Cancer Inst. 2014 Oct 1;106 (11).

33. Domingo L, Salas D, Zubizarreta R et all. on behalf of the INCA Study Group. Tumor phenotype and breast density in distinct categories of interval cancer: results of population-based mammography screening in Spain. Breast Cancer Res. 2014 Jan 10;16 (1): R3.

34. Bucchi L, Puliti D, Ravaioli A et all. Breast screening: axillary lymph node status of interval cancers by interval year. Breast. 2008 Oct;17 (5):477–83.

35. Theriault RL, Litton JK, Mittendorf EA et all. Age and survival estimates in patients who have node-negative T1ab breast cancer by breast cancer subtype. Clin Breast Cancer. 2011 Oct;11 (5):325–40.

36. Curigliano G, Viale G, Bagnardi V et all. Сlinical relevance of HER2 overexpression/amplification in patients with small tumor size and node-negativebreast cancer. J Clin Oncol. 2009 Dec 1;27 (34):5693–9.

37. Livi L, Meattini I, Saieva C et all. Prognostic value of positive human epidermal growth factor receptor 2 status and negative hormone status in patients with T1a/T1b, lymph node-negative breast cancer.Cancer. 2012 Jul 1;118 (13):3236–43.

38. Gonzalez-Angulo AM, Litton JK, Broglio KR et all. High risk of recurrence for patients with breast cancer who have human epidermal growth factor receptor 2-positive, node-negative tumors 1 cm or smaller. J Clin Oncol. 2009 Dec 1;27 (34):5700–6.

39. Schroeder MC, Lynch CF, Abu-Hejleh T et all. Chemotherapy Use and Surgical Treatment by Receptor Subtype in Node-Negative T1a and T1b Female BreastCancers, Iowa SEER Registry, 2010- to 2012. Clin Breast Cancer. 2014 Aug 18. pii: S1526–8209 (14) 00164–5.

40. С. Garbino. St.Gallen international breast cancer conference 2013. Panel voting results, p.1–30.

42. O'Sullivan CC, Bradbury I, de Azambuja E et all. Efficacy of adjuvant Trastuzumab compared with no Trastuzumab for patients with HER2-positive breast cancer and tumors ≤2cm: a meta-analysis of the randomized Trastuzumab trials, ASCO meeting presentation, Chicago 2014.



Контент доступен под лицензией Creative Commons Attribution 4.0 License.

Сегодня больше женщин умирают от рака молочной железы по всему миру, чем от любого другого типа злокачественных новообразований. Клинический ход рака молочной железы значительно варьируется между пациентами. Хотя некоторые из этой изменчивости объясняются традиционными клинико-патологическими факторами (включая возраст пациентов, стадию опухоли, гистологический ранг и статус рецептора эстрогена), исследования молекулярного профилирования определили подтипы рака молочной железы с различными клиническими результатами. Этот мини-обзор рассматривает недавние исследования, которые использовали технологии геномики в попытке идентифицировать новые биомаркеры прогнозов и ответных реакций на лечение. Эти исследования подчеркивают генетическую гетерогенность, которая существует в раке груди в пространстве и времени.

В 2008 году было подсчитано, что ежегодное число новых диагнозов рака молочной железы во всем мире составляло примерно 1,4 млн. Человек, причем менее полумиллиона случаев смерти. Уже давно признано, что клинический курс рака молочной железы значительно варьируется между пациентами. Традиционные клинико-патологические переменные, включая стадию опухоли, статус ранга и эстрогеновых рецепторов, на протяжении десятилетий использовались клиницистами, чтобы помочь прогнозировать и направлять лечение своих пациентов. За последние 30 лет или около того, ряд молекулярно-биологических технологий, включая профилирование экспрессии генов, были использованы для определения молекулярных подгрупп рака молочной железы с различными клиническими результатами
2. В этих исследованиях выявлены рецидивирующие соматические аномалии, включая мутации генов, аберрации числа копий и транслокации, наиболее важным из которых является амплификация ERBB2, присутствующая в 15-20% случаев рака молочной железы
[4]. В этом мини-обзоре рассматриваются недавние исследования, которые использовали геномные технологии в попытке идентифицировать новые биомаркеры прогноза и лечения для пациентов с раком молочной железы.

Степень генетической гетерогенности в опухолях у отдельных пациентов как в пространстве, так и во времени все более хорошо характеризуется
[10]. В одном раннем отчете с использованием цельного геномного секвенирования Shah et al. исследовали парные метахронные опухоли у одного пациента с развитой инвазивной дольковой карциномой молочной железы и обнаружили 19 несинонимических мутаций, присутствующих в метастатических опухолях, которые не были очевидны в первичной опухоли, диагностированной девятью годами ранее
[11].

Stephens et al. проанализировали геномы 100 опухолей для изменения количества копий и мутаций в кодировании экзонов белок-кодирующих генов
[15]. Авторы обнаружили корреляции между количеством соматических мутаций, возрастом, в котором был диагностирован рак, и гистологическим классом опухолей. Новые мутации с водителем были обнаружены у девяти генов рака, включая AKT2, ARIDIB, CASP8, CDKN1B, MAP3K1, MAP3K13, NCOR1, SMARCD1 и TBX3 [15].

Banerji et al. основное внимание было уделено использованию цельной последовательности exome для выявления моделей мутации и транслокации из 103 рака молочной железы из ряда подтипов
[16]. Авторы подтвердили наличие мутаций PIK3CA, TP53, AKT1, GATA3 и MAP3K1, но также идентифицировали рекуррентный сплав MAGI3-AKT3, обнаруженный наиболее часто в ER / PR-отрицательном, HER2-отрицательном раке молочной железы. Функциональные эксперименты показали, что этот ген слияния вызвал конститутивную активацию AKT-киназы, которая поддавалась терапии селективным, маломолекулярным ингибитором АКТ
[16].

В дополнение к исследованиям, использующим геномные методы для определения прогностических биомаркеров, в настоящее время проводится ряд исследований, направленных на идентификацию биомаркеров, которые предсказывают реакцию на терапию. Например, Ellis et al. выполняли целую последовательность exome и целого генома на 31 и 46 образцах, собранных в двух экспериментах по ингибированию неоадъювантных ароматаз
[20]. Наиболее значительным было обнаружение того, что мутант GATA3, по-видимому, коррелирует с вызванным лечением антипролиферативным эффектом
[20].

Наиболее часто мутированные гены рака молочной железы

Резюме данных недавних исследований секвенирования рака молочной железы, приведенных в этом мини-обзоре
[14-17,20,21].

Важно отметить, что высококачественные исследования секвенирования следующего поколения (НГС) характеризуются строгими мерами контроля качества и учебными проектами, которые включают достаточное количество образцов пациентов для точной оценки результатов с низкой распространенностью. Технологии NGS продолжают быстро развиваться, что обусловлено требованием сократить время и стоимость анализа, обеспечивая при этом достаточную глубину и охват
[22].

В отличие от метастатического рака молочной железы, лимфома Ходжкина, рак яичек и острый миелоидный лейкоз могут быть излечены с использованием агрессивной химиотерапии. Однако это не относится к общим метастатическим солидным опухолям. Действительно, высокодозовые стратегии химиотерапии безуспешно преследовались многими исследователями в попытке полностью искоренить все раковые клетки в теле пациента
[27]. По мнению некоторых авторов, эти стратегии потерпели неудачу из-за огромной генетической гетерогенности рака, их пространственной дисперсии и адаптации к множеству местных микросреждений в пределах отдельного пациента
[28]. Предложение состоит в том, что для онкологов для достижения наилучших результатов для своих пациентов должно произойти фундаментальное изменение подхода к каноническому лечению. Искоренение доминантного, хемочувствительного клона может служить только для увеличения селективного давления внутри опухоли, что приводит к расширению хеморезистентных клонов. Вместо того, чтобы убивать максимальное количество клеток, эти авторы предполагают, что мы должны пытаться убить самое меньшее, необходимое для предотвращения прогрессирования опухоли
[28]. Другие указывают на механизмы резистентности к лекарственным средствам, которые могут быть преодолены путем выявления новых целевых лекарств, разработки новых целевых методов лечения и рационального использования комбинаций лекарственных средств
[29,30]. Однако одно ясно. если мы хотим достичь обещания персонализированной медицины, клинические испытания должны будут сопровождаться (с адекватными номерами пациентов) генетическим разнообразием в опухолях, которые существуют в пространстве и времени, в отношении результатов, достигнутых после различных системных терапий.

CNAs: изменение количества копий; CNVs: варианты номеров копий; ER: рецептор эстрогена; ERBB2: Эритробластный лейкоз вирусного онкогена гомолог 2; HER2: эпидермальный фактор роста человека 2; NGS: последовательность последовательности следующего поколения; SNP: полинуклеотиды с одним нуклеотидом.

Авторы заявили, что у них нет конкурирующих интересов.

Рукопись. Оба автора прочли и утвердили окончательную рукопись.

РБ является академическим консультантом в области экспериментальной терапии рака в Кембриджском университете и почетным медицинским онкологом-консультантом в больницах Кембриджского университета NHS Foundation Trust. Его основной исследовательский интерес заключается в разработке новых методов лечения рака и диагностики для пациентов с раком молочной железы.

CC является профессором медицины рака в Кембриджском университете, старшим руководителем группы в Институте исследований рака в Великобритании, а также почетным медицинским онкологом-консультантом в больницах Кембриджского университета NHS Foundation Trust. Он также возглавляет Кембриджский центр экспериментальной онкологической медицины и директор Кембриджского отдела исследований рака молочной железы.

Доступ к этой публикации можно получить здесь:

Мы признаем поддержку Cancer Research UK, Кембриджского университета, Национального института исследований в области здравоохранения Кембриджского биомедицинского исследовательского центра и Кембриджского экспериментального центра медицины рака.

Предметы

Аннотация

Внутриопухолевая неоднородность может привести к смещению выборки и может создать серьезные проблемы для разработки персонализированной медицины и биомаркеров. Несмотря на многочисленные исследования, изучающие генетическую гетерогенность, эпигенетическая внутриопухолевая гетерогенность промоторного гиперметилирования редко диагностируется при раке молочной железы. Чтобы исследовать клональную внутриопухолевую гетерогенность промоторного гиперметилирования, мы выполнили специфичную для метилирования мультиплексную зависимую от лигирования амплификацию зонда (MS-MLPA) для 24 установленных генов опухолевых супрессоров на множественных пространственно разделенных образцах, полученных из 21 первичного рака молочной железы. Был проведен многообластной анализ, представляющий по меньшей мере два и максимум пять блоков опухоли на пациента и четыре области на блок опухоли. Результаты метилирования были гетерогенными в одном или нескольких генетических локусах между различными областями опухоли в 95% карцином молочной железы. Наиболее гетерогенными локусами по убыванию частоты были RASSF1A (62%), CDKN2B (43%), APC (38%), GSTP1 (33%), CDH13 (24%), DAPK1 (19%) и CDKN1B (5%), Неоднородность приводит к изменению статуса метилирования по крайней мере в одном локусе в 65% опухолей. Для большинства генов относительный вклад вариабельности между пациентами и между блоками в общее изменение результатов метилирования был одинаковым. Независимо от гена, вклад изменчивости в пределах блока был незначительным. В заключение, хотя большинство вариаций в статусе метилирования присутствует между отдельными видами рака молочной железы, клональная эпигенетическая гетерогенность наблюдается в большинстве первичных карцином молочной железы, что указывает на то, что метилирование в результате одного случайного образца не может быть репрезентативным для всей опухоли.

Главный

Вариация в пределах одной опухоли, обычно обозначаемая внутриопухолевой гетерогенностью, является теперь широко признанным явлением, характеризующимся секторами (клональная гетерогенность) и даже отдельными клетками (клеточная гетерогенность) различной морфологии, поведения и генетического и эпигенетического состава. В результате сочетания дифференцировки раковых стволовых клеток и клональной селекции под влиянием микроокружения опухоли 1, 2 внутриопухолевая гетерогенность является ключевой переменной для понимания естественной истории опухоли. Это может, однако, привести к смещению выборки и может создать серьезные проблемы для персонализированной медицины, прогнозирования течения заболевания и развития биомаркеров.

Молекулярные данные свидетельствуют о том, что внутриопухолевая гетерогенность может способствовать росту опухоли через разветвленную, а не линейную модель эволюции. 3 Эволюция разветвленной опухоли подчеркивает важность обнаружения повсеместных изменений, присутствующих во всех областях опухоли 4, которые могут привести к превосходным биомаркерам и более эффективной таргетной терапии.

В течение последнего десятилетия было предпринято много попыток выделить и сравнить (эпи) генетически различные субпопуляции с помощью региональной макро- или микродиссекции перед анализом и / или с использованием методов секвенирования следующего поколения. 5, 6 В зависимости от подхода к исследованию (сфокусированный по сравнению с геномом), выборки и разрешающей способности метода анализа, некоторые исследования выявили частую 7, 8, 9, 10 или небольшую 11, 12, 13 внутриопухолевую гетерогенность. Несмотря на многочисленные исследования, посвященные изучению генетической гетерогенности, эпигенетическая внутриопухолевая гетерогенность промоторного гиперметилирования изучалась лишь в редких случаях. 8, 13, 14, 15, 16, 17

Аберрантное промоторное гиперметилирование и связанное с ним молчание генов-супрессоров опухоли происходит на ранних стадиях развития опухоли и может обеспечить избирательное преимущество для опухолевых клеток. Эти эпигенетические изменения потенциально наследуемы при делении клеток и стабильны во времени, но они также могут быть пластичными и специфичными для аллелей. Тем не менее, недавно было показано, что метилирование ДНК поддерживалось во всех метастазах предстательной железы у одного и того же человека, что указывает на то, что эти эпигенетические изменения могут стабильно поддерживаться в качестве изменений генома водителя, способствующих инициации и прогрессированию рака. 13 Аберрантное метилирование ДНК наблюдается при всех типах и стадиях рака, включая рак молочной железы 18, 19, 20, и измерение статуса метилирования конкретных генов в опухолевой ткани или крови может помочь в раннем выявлении рака, определении прогноза и прогнозировании терапии. ответы. Доступен широкий спектр методов для определения уровней метилирования опухоли, 22 некоторые из них с очень высоким разрешением (например, количественная мультиплексная ПЦР-метилирование), но часто требуют конверсии бисульфита и сфокусированного подхода, а другие с более низким разрешением (например, MSP и специфическое для метилирования мультиплексное лигирование, зависящее от амплификации зонда или MS-MLPA). Последний метод не требует превращения бисульфита, но вместо этого основан на рестриктазе и позволяет применять многоцелевой подход для всего лишь 50 нг ДНК, выделенной из фиксированного формалином материала, залитого в парафин.

Чтобы исследовать внутриопухолевую гетерогенность промоторного гиперметилирования, мы выполнили MS-MLPA для 24 установленных генов-супрессоров опухолей (26 локусов) на множественных пространственно разделенных образцах, полученных из 21 первичного рака молочной железы. Многорегиональный анализ, представляющий по меньшей мере два и максимум пять опухолевых блоков на пациента и четыре опухолевых области на опухолевый блок, предоставил доказательства внутриопухолевой гетерогенности между различными блоками одной и той же опухоли и в меньшей степени между различными областями в одном опухолевом блоке.

материалы и методы

материал

Настоящее исследование было выполнено ретроспективно на архивной ткани первичной карциномы молочной железы от 21 пациента, перенесшего операцию в период между 2010 и 2011 годами в Университетском медицинском центре Утрехта. Отобранные первичные протоковые карциномы молочной железы были достаточно большими (в среднем 3 см, в диапазоне 1, 2–4, 9), чтобы можно было взять образцы нескольких отдельных областей, каждая из которых имела диаметр 3–6 мм, для эпигенетического анализа. Средний возраст составлял 60 лет (диапазон 44–81 года), средний индекс митотической активности составлял 13 (диапазон 1–50), и все опухоли, за исключением одной, были положительными по эстрогеновым рецепторам. Восемь опухолей были высокой степени (38%), девять - средней степени (43%) и четыре - низкой степени (19%). Четырнадцать пациентов имели метастазы в лимфатические узлы (67%). Исследование проводилось в соответствии с этическими принципами. Анонимное использование избыточной ткани в исследовательских целях является частью стандартного соглашения о лечении с пациентами в Университетском медицинском центре Утрехта. 23

Отбор проб и экстракция ДНК

Срезы по четыре микрометра вырезали из каждого фиксированного в формалине парафинового блока ткани и окрашивали гематоксилином и эозином. Срез гематоксилина и эозина использовали для регистрации преинвазивных поражений, некроза и смешанного лимфоцитарного инфильтрата, а также для направления микродиссекции для выделения ДНК. Для выделения ДНК на основе протеиназы К были вырезаны пять слайдов толщиной 10 мкм , и участки опухоли были микродиссектированы с помощью скальпеля. Как показано на рисунке 1, для каждого пациента один опухолевый блок был разделен на четыре неперекрывающиеся области примерно одинакового размера, и ДНК была выделена из каждой из них отдельно и из опухолевого блока в целом. Другие опухолевые блоки от того же пациента были также проанализированы в целом. Когда это было возможно, использовали непоследовательные опухолевые блоки. Участки с некрозом, плотными лимфоцитарными инфильтратами и преинвазивными поражениями были намеренно исключены. Концентрацию и поглощение ДНК при 260 и 280 нм измеряли с помощью спектрофотометра (NanoDrop ND-1000, Thermo Scientific).


Схема выборки. От каждой опухоли анализировали от двух до пяти (показано: четыре) предпочтительно непоследовательных опухолевых блоков. Один из опухолевых блоков был дополнительно разделен на четыре неперекрывающиеся области примерно одинакового размера, и ДНК извлекалась из каждого из них отдельно и из опухолевого блока в целом. Другие опухолевые блоки также были проанализированы в целом.

Изображение в полном размере

МС-ММПУ

MS-MLPA выполняли в соответствии с протоколом производителя с использованием зонда SALSA MS-MLPA ME001-C1. Опухоль-супрессор-1, содержащего 15 контрольных зондов и 26 HhaI-чувствительных зондов против TP73, CASP8, VHL, RARB, MLH1 (2 локуса), RASSF1A. (2 локуса), FHIT, APC, ESR1, CDKN2A / B, DAPK1, PTEN, CD44, GSTP1, ATM, CADM1, CDKN1B, CHFR, BRCA1 / 2, CDH13, HIC1 и TIMP3 . По меньшей мере 50 нг ДНК использовали в каждой реакции MS-MLPA. Все реакции проводили в 96-луночном термоциклере Veriti (Applied Biosystems). 100% метилированный (обработанный sssI метилтрансферазой) контроль и отрицательный контроль (ДНК спермы человека) брали вместе в каждом опыте MLPA. Разделение фрагментов проводили капиллярным электрофорезом на капиллярном секвенаторе ABI-3730 (Applied Biosystems). Модели пиков, полученные из Genescan Analysis, были оценены с использованием программного обеспечения Genemapper (версия 4.1) и программного обеспечения Coffalyser (версия 9.4, MRC-Holland). Результаты считались достоверными, если число контрольных проб в пределах нормального диапазона (коэффициент дозировки> 0, 7) составляло ≥12. Образец считали метилированным, когда коэффициент дозировки был> 0, 15, как и раньше. 18

Установление MLPA Критериев гетерогенности

Образцы, взятые из каждой опухоли, оценивали на гетерогенность в каждом локусе путем расчета стандартного отклонения и разницы между максимальной и минимальной частями дозировки. Фактор гетерогенности дозы считали присутствующим, если стандартное отклонение (sd) между различными областями и блоками от одной и той же опухоли было> 0, 07. Это число представляет максимальный sd, наблюдаемый для любого локуса без метилирования между повторными или межпроизводными измерениями MS-MLPA. Поскольку известно, что sd выше в высоко метилированных локусах (максимум sd 0, 18), также сообщалось о влиянии гетерогенности на вызов статуса метилирования.

Статистика

Для оценки вклада внутри опухоли (между блоками, а также внутри блоков) и дисперсии между опухолями к общему отклонению, наблюдаемому в значениях коэффициента дозировки, была использована общая линейная модель (для вложенного несбалансированного ANOVA с ошибкой типа III), Для оценки связи гетерогенности с клинико-патологическими переменными использовался критерий χ2. Все статистические расчеты были выполнены с использованием статистики IBM SPSS 21.

Результаты

Дополнительная таблица 1 показывает результаты MS-MLPA для всех проанализированных областей опухоли и опухолевых блоков. Метилирование в одном или нескольких субрегионах опухоли часто наблюдалось для APC (90%), RASSF1A (81%), CDH13 (76%), CDKN2B (57%) и GSTP1 (52%). Метилирование DAPK1 (33%), TP73 (14%), ESR1 (10%) и CDKN1B (5%) встречалось реже.

Частота неоднородности

На основании критерия стандартного отклонения> 0, 07, 20/21 (95%) опухоли молочной железы показали внутриопухолевую гетерогенность в одном или нескольких исследованных локусах (таблица 1, рисунок 2). Наиболее гетерогенными локусами, обнаруживаемыми MS-MLPA с понижающейся частотой, были RASSF1A (62%), CDKN2B (43%), APC (38%), GSTP1 (33%), CDH13 (24%), DAPK1 (19%) и CDKN1B (5%). Все остальные локусы не показали внутриопухолевой гетерогенности ( CASP8, VHL, RARB, MLH1, ATM, FHIT, CDKN2A, PTEN, CD44, IGSF4, CHFR, BRCA1 / 2, HIC1, TIMP3 ). Эта гетерогенность приводит к изменению статуса метилирования (частичное ограничение дозы 0, 15) по крайней мере в одном локусе в 13/20 (65%) опухолях молочной железы. Локусами, пораженными гетерогенностью, приводящей к изменению статуса метилирования между / внутри опухолевыми блоками, были CDKN2B (43% от всех 21 образцов), RASSF1A (14%), APC (10%), GSTP1 (10%), CDH13 (10%), DAPK1 (5%) и CDKN1B (5%). Гетерогенность в метилировании наблюдалась между различными блоками одной и той же опухоли, а также между различными областями в пределах одного и того же блока (рис. 2).

Таблица в натуральную величину


Два образца, показывающие гетерогенность между блоками и внутри блоков при метилировании с помощью MS-MLPA. Ось X показывает 26 локусов, ось Y показывает значения фактора дозировки. Образец 7 (вверху) показывает гетерогенность внутри блока для CDH13 (не приводящую к изменению статуса метилирования) и гетерогенность между блоками для CDKN2B. Образец 19 (внизу) показывает поразительную гетерогенность внутри блока для RASSF1A, APC и DAPK1.

Изображение в полном размере

Относительный вклад гетерогенности между блоками, внутри блоков и между пациентами (между опухолями)

На рисунке 3 показан относительный вклад межопухолевой и внутриопухолевой межблочной и внутриблочной изменчивости в общую дисперсию. Для большинства генов, за исключением TP73, RARB, RASSF1A, FHIT, APC, DAPK1, GSTP1, CDH13 и BRCA1 , относительный вклад межопухолевой и межблочной вариабельности в общую вариабельность между наблюдениями был сходным. Для других генов межопухолевая изменчивость была основной причиной гетерогенности, что дало до 97% модели. Независимо от гена, вклад изменчивости внутри блока был незначительным или не имел значения (не более 11%).


Относительный вклад дисперсии между опухолями и внутриопухолями между блоками и внутриблоковой изменчивостью.

Изображение в полном размере

Гетерогенность и клинико-патологические переменные

Степень гетерогенности, определяемая количеством гетерогенных локусов в образце, не коррелировала ни с одной из клинико-патологических переменных (степень, состояние лимфатического узла, митотический индекс, размер опухоли, возраст или статус HER2).

обсуждение

В свете многообещающего биомаркерного потенциала оценки метилирования при раке молочной железы в этом исследовании использовалась региональная микродиссекция опухолей молочной железы, чтобы выяснить, может ли MS-MLPA обнаруживать эпигенетически различные субпопуляции в географически различных опухолевых секторах (блоках и участках). Результаты метилирования были гетерогенными (в 1 или более локусах) между различными субрегионами опухоли во всех, кроме одной из исследованных карцином молочной железы (95%). Степень гетерогенности варьировала между исследуемыми опухолями молочной железы, варьируя от одного гетерогенного локуса (4%) до шести гетерогенных локусов (23%) на опухоль. Наиболее гетерогенными локусами, обнаруживаемыми MS-MLPA с понижающейся частотой, были RASSF1A (62%), CDKN2B (43%), APC (38%), GSTP1 (33%), CDH13 (24%), DAPK1 (19%) и CDKN1B (5%). Все остальные локусы не показали внутриопухолевой гетерогенности. Наблюдаемая гетерогенность не всегда приводила к изменению статуса метилирования между различными областями опухоли; гетерогенность приводит к изменению статуса метилирования по меньшей мере в одном локусе в целых 65% опухолей молочной железы.

Гетерогенность в метилировании наблюдалась между различными блоками, а также между различными областями одного опухолевого блока, но на основе общей линейной модели вклад изменчивости внутри блока в общую вариабельность коэффициента дозы между образцами и внутри них был минимальным. Для TP73, RARB, RASSF1A, FHIT, APC, DAPK1, GSTP1, CDH13 и BRCA1 изменчивость между опухолями была основной причиной общей гетерогенности, составляющей до 97% в модели. Для всех других генов, включая CDKN2B , относительный вклад межопухолевой и межблочной вариабельности в общую вариабельность между наблюдениями был сходным. Эти результаты свидетельствуют о значительной межиндивидуальной гетерогенности и указывают на гораздо большую стабильность на уровне внутри блока по сравнению с уровнем между блоками.

Таким образом, мы продемонстрировали, что клональная эпигенетическая гетерогенность присутствует в большинстве первичных карцином молочной железы и может приводить к нарушению статуса метилирования, вызываемого MS-MLPA, что указывает на то, что анализ одной случайной выборки не может быть репрезентативным для всей опухоли, что может препятствовать обнаружение и проверка эпигенетического биомаркера. Межопухолевая гетерогенность была, тем не менее, более выраженной, чем внутриопухолевая гетерогенность. Хотя ограниченная внутриопухолевая гетерогенность наблюдалась между различными областями в одном опухолевом блоке и могла привести к разбавлению общего сигнала метилирования, гетерогенность между различными блоками одной и той же опухоли была значительно больше и, следовательно, более проблематичной для клинических целей.

Читайте также:

Пожалуйста, не занимайтесь самолечением!
При симпотмах заболевания - обратитесь к врачу.