Что такое иммунофенотипирование лейкозов

Иммунофенотипирование клеток – это определение поверхностных маркеров и, соответственно, принадлежности клеток к той или иной субпопуляции. Это метод, основанный на реакции антител с антигенами и используемый для определения специфических типов клеток в образцах крови, костного мозга, лимфатических узлов или других тканей. К антителам, которые реагируют со специфическими антигенами клеток, присоединена особая флюоресцентная метка, которая обнаруживается при помощи проточных цитометров или люминесцентных микроскопов.

Иммунофенотипирование с использованием метода проточной цитометрии имеет преимущества перед использованием других методов за счет большей точности, скорости, возможности одновременной регистрации нескольких антигенов на одной клетке. В настоящее время иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга является "золотым стандартом" в диагностике иммунодефицитов, лимфопролиферативных, аутоиммунных и инфекционных заболеваний.

Целью исследования явилось обобщение данных, полученных при иммунофенотипировании острых лимфобластных (ОЛЛ) и миелобластных лейкозов (ОМЛ) с 2007 по 2010 гг.

Материалы и методы исследования

Было обследовано 612 детей за период с 2007 по 2011 год. Иммунофенотипирование опухолевых клеток костного мозга с помощью проточной цитометрии проводили методом прямой иммунофлуоресценции с использованием моноклональных антител (МАТ) фирмы Becton Dickinson (USA).

Подготовка проб: Во все пробирки вносили 50 мкл костного мозга. Затем добавлялись поверхностные антитела по 20 мкл. Панель маркеров, используемая для диагностики острых лейкозов: G1/G2/CD45, CD10/CD19/CD45, CD34/CD14/CD45, CD22/CD13/CD45, CD7/ CD117/CD45, CD20/CD33/CD45, HLA-DR/CD34/CD45, CD5/CD3/CD45, CD4/CD8/CD45, CD2/CD11c/CD45, CD41a/CD61/CD45, CD15/CD56/CD45, CD38/GlyA/CD45, Kappa/Lambda/ CD45, TdT/CD79a/CD45, cyIgM/МРО/CD45. Перемешивали на Vortex. Инкубировали в темноте в течение 15 минут. Добавляли 1 мл Lysing solution (Becton Dickinson, USA). Инкубировали в темноте 10 минут. Перемешивали на Vortex. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Добавляли 1000 мкл Permeafix (Becton Dickinson, USA). Перемешивали на Vortex. Инкубировали в темноте 30 минут. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Добавляли 1000 мкл Facs Flow (Becton Dickinson, USA). Перемешивали на Vortex. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Для выявления цитоплазматических маркеров: добавляли цитоплазматические антитела по 2,5 мкл. Инкубировали с антителами в темноте – 15 минут. Добавляли 1000 мкл Facs Flow (Becton Dickinson, USA). Перемешивали на Vortex. Центрифугировали 5 минут. Снимали надосадочную жидкость. Добавляли 500 мкл Facs Flow. Перемешивали на Vortex. Анализ образцов проводили на проточном цитофлуориметре FacsCalibur (Becton Dickinson, USA) в программе CellQuest.

При математической обработке полученных результатов использовали корреляционный анализ, определение доверительных интервалов. Для сравнения средних величин в процессе статистической обработки полученных данных использовали вычисление критерия достоверности разницы (t-критерий Стьюдента). Различия признавали статистически значимыми при р 1. Структура иммунологических вариантов острых лейкозов

Проанализировано иммунофенотипирование острых лейкозов в Научном центре педиатрии и детской хирургии за период с 2007 по 2011 годы, в течение которого было проведено 715 иммунофенотипирований. Из них 103 больных (14,4%) поступили с рецидивами заболевания. Далее рассматриваются только первичные варианты иммунофенотипирования.

Структура иммунологических вариантов острых лейкозов


Наибольшее количество лейкозов пришлось на долю лимфобластных лейкозов - 70,5% (345 больных) (рис. 1). Нелимфобластные острые лейкозы составили 26,4% (129 больных). Бифенотипические варианты острых лейкозов составили 3,1% (15 больных).

Частота выявления различных фенотипических вариантов


Среди лимфобластных лейкозов основную долю заняли В-линейные острые лейкозы, которые составили 62,4% (305 больных), 26,4% пришлось на долю острых миелобластных лейкозов (129 больных) (рис. 2). У 40 больных (8,2%) был выявлен Т-лимфобластный лейкоз. На долю бифенотипических лейкозов пришлось 3,1% (15 больных).

Фенотип common-B варианта (В2) составил наибольшую группу 48,9% (239 больных) среди В-лимфобластных лейкозов. 4,1% (20 больных) составили больные из группы с про-В вариантом острого лимфобластного лейкоза (В1), с пре-В вариантом – 9,2% (45 больных). Один случай зрелого варианта ОЛЛ - В4 (0,2%).

Среди ОМЛ наиболее часто встречались варианты острых миелобластных лейкозов с созреванием и без созревания, которые мы отнесли в одну группу. Они составили 15,1% (74 больных). Далее 4,5% (22 больных) пришлось на долю острых промиелоцитарных лейкозов, миеломоноцитарные и моноцитарные лейкозы (М4-М5) составили 3,9% (19 больных), самая малочисленная группа недифференцированных лейкозов (М0) - 2,7% (13 больных). На долю бифенотипических острых лейкозов пришлось 3,1% (15 больных).

2. Уровень экспрессии антигенов при различных вариантах острых лейкозов

Основные маркеры, уровень экспрессии которых был наиболее высоким при Т-лимфобластных острых лейкозах, мы отнесли в одну группу: CD7, CD2, CD5, CD3, CD8, CD4. Маркеры перечислены в порядке убывания степени экспрессии.

3. Частота встречаемости неродственных антигенов при острых лимфобластных лейкозах

Влияние коэкспрессии миелоидных маркеров на клинико-гематологические и прогностические особенности острых лейкозов у детей является предметом дискуссий (3, 6). Оценка прогностической роли неродственных (линейно-неспецифических) миелоидных маркеров на лимфобластах достаточно разноречива. Некоторые авторы связывают коэкспрессию миелоидных маркеров с неблагоприятным прогнозом, другие считают, что этот процесс не влияет на прогноз (2, 3).

При анализе выявляемости миелоидных маркеров среди подвариантов острых лимфобластных лейкозов достоверной разности в коэкспрессии выявлено не было. Однако, при В1 и В2 подвариантах чаще выявлялась коэкспрессия CD13, CD15, CD33, антигенов, а также МРО. Среди пре В- вариантах ОЛЛ – CD15, CD13, CD33. Только среди В2-подвариантах ОЛЛ встречалась коэкспрессия CD14-, CD2-антигенов. В случае единственного установленного зрелого В-варианта ОЛЛ была выявлена коэкспрессия цитоплазматического маркера МРО.

При изучении коэкспрессии Т-лимфобластных лейкозов, которые были выделены нами в одну группу, очевидно, что коэкспрессия миелоидных маркеров встречалась только в половине процентов случаев. Достоверно чаще встречалась коэкспрессия CD13-антигена и МРО.

4. Частота встречаемости неродственных антигенов при острых миелобластных лейкозах

При анализе частоты выявления лимфоидных антигенов при миелобластных лейкозах, коэкспрессия неродственных маркеров достоверно не отличалась при различных вариантах острых миелобластных лейкозов. Наибольшую долю при всех миелоидных подвариантах лейкозов составила коэкспрессия антигена CD19, причем, при ранних вариантах ОМЛ (М0, М1-М2) она была выше, чем при М3, М4-М5 вариантах. Следующей по частоте была коэкспрессия лимфоидного антигена CD4, которая возрастала с ростом дифференцировки бластов (от М1-М2 к М4-М5 вариантам). Наиболее редкой была коэкспрессия лимфоидных маркеров CD2, CD5, CD7, CD79a, CD3. При этом надо отметить, что иммунофенотипы имели коэкспрессию одного, двух и более неродственных маркеров в различных сочетаниях.



5. Коэкспрессия антигенов при различных вариантах острых лимфобластных лейкозов

В результате наших исследований в 2/3 случаев были выявлены бластные клетки, имеющие на своей поверхности и/или в цитоплазме антигены, присущие различным гемопоэтическим линиям (рис. 3).


В случае лимфобластных лейкозов коэкспрессия миелоидных антигенов была выявлена в 69,9± 2,5% (241) случаев.

Частота коэкспрессии миелоидных антигенов на лимфобластах (рис. 4) была различной в зависимости от варианта. Так, при В1-варианте ОЛЛ она составила 75,0% (24), при В2 – 77,2% (274), при В3 – 75,8% (47), при Т – 48,9% (23).


Коэкспрессия лимфоидных антигенов при различных вариантах ОМЛ.


6. Средняя интенсивность флюоресценции

Средняя интенсивность флюоресценции миеломаркеров CD14, CD13, CD117, CD33, MPO гораздо выше при специфической экспрессии при ОМЛ, чем выявляемых в качестве коэкспрессии при ОЛЛ (табл. 3). Аналогично, средняя интенсивность флюоресценции лимфомаркеров CD19, CD10, CD22, CD20 выше на бластных клетках ОЛЛ, чем ОМЛ. Надо отметить, что средняя интенсивность флюоресценции HLA-DR и CD34 гораздо выше при ОМЛ, чем при ОЛЛ.


В таблице 3 представлены СИФ различных маркеров при подвариантах ОЛЛ и ОМЛ. Пан-В-клеточный маркер CD19 характеризовался наиболее высокой степенью интенсивности флюоресценции на лейкозных клетках при пре-B-вариантах ОЛЛ. CD10-антиген имел наибольшую СИФ при common-B-варантах ОЛЛ, наиболее низкую – при про-В-вариантах ОЛЛ. СИФ В-линейного маркера CD20, а также молекулы HLA-DR резко увеличивался по мере повышения дифференцировки бластных клеток. СИФ стволовоклеточного маркера CD34 резко снижалась от В1 к В3-подвариантам ОЛЛ.

Выводы

  1. В структуре иммунологических вариантов ОЛ детей РК за период с 2007 по 2010 г.г. с большей частотой (70,5%) встречается острый лимфобластный лейкоз, а среди лимфобластных - common-вариант (В2) - в 48,9% случаев
  2. При ОЛЛ в 69,9±2,5% выявлена коэкспрессия миелоидных антигенов. Наиболее часто встречаемый неродственный маркер при ОЛЛ – CD13.
  3. При ОМЛ коэкспрессия неродственных антигенов составила 73,6±3,9%. Наиболее часто встречаемый неродственный маркер при ОМЛ – CD19.
  4. Значительно реже в Казахстане выявлялся мегакариоцитарный вариант острого лейкоза (1 случай за 6 лет) в сравнении с Россией и странами Европы, что может свидетельствовать об особенностях острых лейкозов в нашей республике.
  5. Средняя интенсивность флюоресценции миеломаркеров CD14, CD13, CD117, CD33, MPO гораздо выше при специфической экспрессии при ОМЛ, чем выявляемых в качестве коэкспрессии при ОЛЛ. Аналогично, средняя интенсивность флюоресценции лимфомаркеров CD19, CD10, CD22, CD20 выше на бластных клетках ОЛЛ, чем ОМЛ.

Одним из методов клинической диагностики является исследование крови способом иммунофенотипирования лимфоцитов. В его основе реакция между антителами и антигенами, которая используется для определения типов клеток крови, взятых из образцов биологического материала – крови, лимфатических узлов или костного мозга.

Анализ проводится с использованием специальных маркеров или меток, которые присоединяются к антигенам клеток. С помощью лабораторного оборудования отслеживают маркеры, производят подсчет клеток крови. Знание количества каждой из них позволяет квалифицировать опухолевые заболевания, подтвердить диагноз пациенту с определением конкретного его типа, например: достоверно установить вид лимфомы, лейкоза. Такая точная диагностика позволяет сделать выбор наиболее эффективной схемы лечения.

  1. Метод исследования, условия, необходимые для проведения
  2. Количественный состав каких клеток отражает результат анализа?
  3. Когда назначают исследование?
  4. Какие проблемы отражают повышенные и пониженные Т-клеточные лимфоциты
  5. Колебание числа В-лимфоцитов
  6. Отклонения показателей естественных киллеров
  7. Показатели Т-цитотоксических лимфоцитов
  8. Какие процессы определяются по уровню Т-хелперов
  9. Отклонения значений по уровню Т-ЕК клеток

Метод исследования, условия, необходимые для проведения

Иммунофенотипирование – это исследование лимфоцитов, которое помогает увидеть клетки крови, распознать их принадлежность к определенному виду. Исследование проводят с использованием современного диагностического оборудования – цитофлюориметров или особых микроскопов, способных опознавать люминесцирующие составляющие, которые помогают различать разновидности люминесцирующих кровяных телец, вести точный их подсчет в каждой пробе. Оборудование позволяет опознать каждую из меток. Маркирование клеток это добавление в пробу антикоагулянта (реагент К2ЭДТА).

Забор образца для анализа производится из вены в области локтевого сустава. Для точного результата пациент должен соблюсти условия – проба берется натощак в утреннее время. В некоторых случаях допускается легкий прием пищи за 4 часа до процедуры, пациенту можно выпить небольшое количество обычной воды. Занятия спортом накануне диагностики или прием алкоголя запрещен, нарушение запрета приводит к искаженным результатам анализа. Повышенная психоэмоциональная нагрузка недопустима.

Для взятия крови специалист использует вакуумную пробирку. Ее применение позволяет достичь точного результата исследования, снизить болевые ощущения, точно произвести соотношение биологического материала и реагента.

После того, как образец поместили в пробирку, лаборант перемещает взятую пробу с антикоагулянтом, для этого требуется 10 раз медленно перевернуть емкость.

Для хранения и транспортировки материала для анализа требуется соблюдение условий: температурного режима при хранении образца от 18 до 23°С, сохранения положения пробирки вертикально. Срок ожидания результатов не превышает 24 часов от взятия пробы. Время проведения исследования 4 часа.


Количественный состав каких клеток отражает результат анализа?

В ходе проведения исследования специалисты клинической лаборатории отслеживают показатели в периферической крови пациента, возможные поражения. На бланк анализа заносят показатели:

Когда назначают исследование?

  • инфекционных заболеваниях, поражении хронического характера или если болезнь имеет затяжной характер,
  • аллергических реакциях организма,
  • проявлении устойчивых признаков и симптомов, указывающих на иммунодефицит врожденного или приобретенного свойства,
  • подозрении на опухолевые образования доброкачественной или злокачественной природы,
  • заболеваниях аутоиммунного типа, спровоцированных расстройством защитной системы, поражением собственного организма,

Диагностика периферической крови требуется в других случаях. Ее назначат перед серьезным оперативным вмешательством, которое требуется больному в плановом порядке. При иммунофенотипировании врач узнает все процессы иммунного характера, происходящие у конкретного больного, что позволяет скорректировать защитные процессы, избежать клеточного поражения, и нормализовать их работу. Большое значение для врача имеют показатели различных видов кровяных телец, Т-клеточный состав крови в послеоперационный период, особенно в случаях с развитием патологических процессов.

Метод применяют и для оценки состояния человека, которому требуется трансплантация органов или проведена операция – анализ на иммунофенотипирование проведут на подготовительном этапе и во время послеоперационного восстановления, чтобы предупредить поражение и отторжение органа. Направление на анализ получают пациенты, лимфоциты которых могут изменить качественный и количественный состав из-за лечения заболеваний медикаментами определенных групп – иммуномодуляторами, иммунодепрессантами или цитостатиками.

Нормы и референсные значения содержания в крови частиц определенного вида зависят от возраста пациента. Врачи для оценки показателей используют специальные таблицы, в которых указаны оптимальные значения, пределы отклонений.


Какие проблемы отражают повышенные и пониженные Т-клеточные лимфоциты

Результат анализа покажет отклонение от нормы по количеству Т-клеточных лимфоцитов. Повышение их количества свидетельствует об иммунном воспалении, поражении или гиперактивности защитных процессов пациента. Такое превышение нормы вызывают заболевания – лимфолейкоз (острая и хроническая стадии), ряд вирусных и бактериальных инфекций в начале развития болезни. Увеличение Т-лимфоцитов возможно при изменении характера заболевания, переход его в хроническую форму.

Если у обследуемого абсолютное число Т-клеточных лимфоцитов снижено, говорят о развитии иммунологического паралича. Он сопровождает воспалительный процессы, может указывать на развитие злокачественных опухолевых новообразований. Такой показатель выявляется, если больная сердечная мышца – миокард, при некоторых сложных травмах, его снижение вызывает курение.

Колебание числа В-лимфоцитов

Увеличение числа В-лимфоцитов сигнализирует о поражении организма воспалительным процессом, развивающимся в острой или хронической стадии. Его природа аллергического, аутоиммунного или инфекционного характера. Эти лимфоциты увеличиваются из-за В-лимфолейкоза, бронхиальной астмы, муковисцидоза, больной печени и при хронических патологиях. Увеличенные показатели по В-лимфоцитам в анализе отражают восстановление после инфекций, перенесенных в острой и тяжелой форме.

Если число В-лимфоцитов не соответствует нижним пределам нормы, при проведении дополнительной диагностики врач подтвердит пациенту развитие опухолевых новообразований, острые вирусные инфекции или инфекции бактериального типа, развитие очагов воспаления в организме больного.

Отклонения показателей естественных киллеров

Повышенному уровню естественных киллеров способствуют патологические процессы, связанные с:

  • запуском онкологических процессов,
  • тяжелым течением воспалительного процесса, воспалительные заболевания в хронической стадии,
  • с избыточной выработкой антигенов, борющихся с бактериальным или вирусным процессом.

Содержание в клетках крови естественных киллеров может быть снижено из-за повышения уровня в крови Т-лимфоцитов и связано с процессами, вызывающими такое повышение.

Показатели Т-цитотоксических лимфоцитов

Если значение показателя CD8+ в превышающих норму цифрах, закономерно заподозрить опухолевое заболевание, вирусный процесс в активной стадии (при развитии вирусной, грибковой или внутриклеточной инфекции, заболеваний подобного типа).

Сниженные значения Т-цитотоксических лимфоцитов в результатах анализа предупреждают о процессах, развивающихся на фоне аутоиммунных болезней. Такой процесс подтверждает атаку аллергенов, развитие аллергии на момент обследования.

Какие процессы определяются по уровню Т-хелперов

Повышение содержание Т-хеплеров свидетельствует об остром воспалительном процессе в активной стадии. Иммунное воспаление отражает увеличение Т-хеплеров первого типа, рост показателя по второму типу определяет наличие воспалительного процесса аллергической природы. Обострение аутоиммунной патологии определяется, если Т-хеплеры обоих типов увеличены.

Снижение Т-хелперов происходит из-за состояния иммунологического паралича, выявляет иммунодефицит вторичного типа у больного.

Отклонения значений по уровню Т-ЕК клеток

Количество Т-ЕК клеток повышается, увеличиваясь по отношению к референсным значениям их содержания в крови по причине:

  • наличия хронических воспалительных процессов с длительным периодом воздействия на иммунную систему,
  • воспалительных процессов, сопровождаемых тяжелым протеканием, осложнениями при лечении,
  • сохранение инфекции в активном состоянии в клетках организма на протяжении значительного периода времени.

Сниженные лимфоциты такого вида не отображают значимые процессы, не являются важными для диагностики.

Использование метода иммунофенотипирования лимфоцитов позволяет проводить диагностику патологий, заподозрить развитие опасных, опухолевых болезней. Метод является безопасным для обследуемого, не требует значительных финансовых затрат.

*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Читайте в новом номере

к.м.н. Л.Ю. Андреева, профессор М.А. Волкова, профессор М.А. Френкель

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН


В ыделение на основании исходных прогностических факторов группы больных, имеющих низкую вероятность достижения ремиссии или высокий риск развития рецидива с целью индивидуализации лечения, является перспективным направлением в современной терапии злокачественных новообразований. Необходимость разработки индивидуальных подходов к терапии различных по прогнозу групп больных продиктована потребностями клиники. Такой подход может основываться только на углубленном изучении молекулярно–биологических особенностей опухолевой клетки. Одним из методов, раскрывающим новые перспективы в понимании антигенных, биохимических и гистогенетических характеристик клеточных структур и дающих возможность глубже понять природу опухоли, особенности ее возникновения, развития и прогрессирования, является иммунофенотипирование. С появлением высокоспецифичных реагентов – моноклональных антител (мкАТ), позволяющих определять и разграничивать специфические антигенные детерминанты, онкологи получили возможность более точного определения диагноза и прогноза заболевания, а также выбора наиболее оптимальной тактики лечения пациента. Неоспоримыми достоинствами иммунофенотипирования являются его высокая чувствительность, специфичность и относительная простота. Данный метод обеспечивает детальную характеристику фенотипа опухоли при диагностике, позволяет идентифицировать отдельные остаточные опухолевые клетки, персистирующие в организме больного во время ремиссии.

Наибольшее развитие метод иммунофенотипирования получил при опухолях крови. Основным и, пожалуй, единственным на сегодняшний день методом лечения гемобластозов является химиотерапия. На примере острых лейкозов наглядно демонстрируется возрастание роли молекулярно–биологических (иммунофенотипических) факторов прогноза по мере интенсификации программ химиотерапии. При этом стандартные прогностические факторы (клинические, гематологические, морфоцитохимические) утрачивают свое значение и отходят на второй план. Эволюция взглядов на факторы прогноза, наблюдаемая при гемобластозах человека и указывающая на возрастание роли иммунофенотипа в условиях современных схем химиотерапии, может явиться своего рода моделью и для ряда соматических опухолей, являющихся объектами химиотерапии, при которых иммунофенотипические подходы пока еще разработаны недостаточно.

Иммунофенотипирование является обязательным методом исследования при гемобластозах в целом и при острых нелимфобластных лейкозах (ОНЛЛ), в частности. Помимо диагностического аспекта, значение изучения иммунофенотипа бластных клеток при ОНЛЛ заключается в том, что наличие некоторых антигенных детерминант ассоциируется с агрессивностью течения и результатами терапии [4, 7, 8, 13, 15, 20]. На сегодняшний день решены еще не все вопросы относительно прогностической ценности экспрессии тех или иных антигенов при ОНЛЛ и последствий, которые влечет за собой их обнаружение с точки зрения лечебной тактики. Представленные в нашей работе результаты отражают общие тенденции комплексного и углубленного изучения иммунофенотипической характеристики ОНЛЛ во взаимосвязи с прогнозом заболевания, которое ведется в крупнейших клиниках мира.

Характеристика больных и методы исследования

Установление диагноза ОНЛЛ и определение морфоцитохимического варианта заболевания осуществлялось в соответствии с критериями FAB–классификации.

Определение иммунологического фенотипа бластных клеток проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием широкой панели моноклональных антител (мкАТ). Набор мкАТ варьировал в разные годы проведения исследований и в наиболее полном виде включал миелоидные (CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33), эритроидные (HAE–3, HAE–9), линейно не рестриктированные (CD10, CD34, CD38, HLA–DR), Т–клеточные (CD2, CD4, CD5, CD7) и В–клеточные (CD19, CD22) антигены. Мегакариоцитарные маркеры (CD41, CD61) исследовались по показаниям. Оценка результатов проводилась на проточном цитометре FАСScan (Becton Dickinson, CША) в гейте бластных клеток, идентифицируемых на основании характеристик светорассеяния. Антиген–положительными считались случаи с экспрессией маркера на более чем 20% лейкемических клеток.

Сравнение влияния иммунологических маркеров на частоту полных ремиссий (ПР) больных с наличием или отсутствием экспрессии антигенов на мембране бластных клеток производилось по таблицам сопряженности признаков. Достоверность различий оценивалась по критерию Хи–квадрат. Сравнение кривых общей и безрецидивной выживаемости (ОВ и БРВ соответственно), построенных по методу Каплан–Майера, проводилось с использованием Log–Rank теста. Различия считались достоверными при р Результаты и обсуждение

Распределение 120 больных с различными морфоцитохимическими вариантами в каждой из лечебных групп представлено в таблице 1. На основании литературных данных и опыта отделения химиотерапии гемобластозов РОНЦ морфоцитохимические варианты ОНЛЛ были разделены на прогностически благоприятные (М1, М2, М3, М4эоз) и прогностически неблагоприятные (М0, М2баз, М4, М5, М6, М7). Во всех группах, за исключением аклакур–цитарабиновой, преобладали прогностически благоприятные FAB–варианты. Статистический анализ во всех 4–х группах не выявил достоверных различий в возрасте, частоте тех или иных клинико–гематологических показателей и клинических симптомов. Результаты использования цитарабина с различными антрациклиновыми производными приведены в табл. 2.

В настоящее время адекватная цитостатическая и симптоматическая терапия позволяет преодолевать многие отрицательные клинико–гематологические факторы, которые до 1980–х годов оказывали решающее влияние на прогноз ОНЛЛ. С возрастанием интенсивности терапии роль некоторых из этих факторов (например, глубины тромбоцитопении и анемии, процентного содержания бластных клеток в крови и костном мозге) полностью нивелировалась, однако другие признаки (возраст, уровень лейкоцитов, морфоцитохимическая характеристика бластных клеток), самостоятельно или в совокупности, по–прежнему сохраняют свою прогностическую значимость [5, 16, 19]. В условиях различных химиотерапевтических режимов роль клинико–гематологических факторов прогноза нами была подтверждена. При этом особенности использованной программы терапии накладывали свой отпечаток на реализацию тех или иных прогностических факторов. Из табл. 3 видно, что при применении современных программ химиотерапии, в частности, при использовании идарубицина, прогностическая роль общепринятых клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов практически полностью нивелируется. Таким образом, в условиях интенсивных химиотерапевтических режимов достаточно сложно, опираясь только на вышеуказанные факторы прогноза, определять степень агрессивности опухолевого процесса до начала лечения. С этой целью была проанализирована роль иммунологических особенностей лейкозных клеток больных ОНЛЛ.

Уникальной особенностью бластных клеток при ОНЛЛ является сохранение ими дифференцировочного статуса клеток–предшественников гемопоэза. Однако в отличие от нормальной клеточной дифференцировки, при которой невелик процент клеток, коэкспрессирующих маркеры различных линий и стадий гемопоэза, при ОНЛЛ одновременная экспрессия в норме не встречающихся антигенов определяется в 85% случаях [21]. Таким образом, лейкозный клон клеток, имеющий однородные морфоцитохимические характеристики, является гетерогенным по антигенной структуре бластных элементов, и перспективы иммунофенотипического изучения злокачественных элементов при ОНЛЛ поистине многообразны.

На основании проведенного клинико–иммунологического анализа нам удалось доказать неоднородность терапевтического ответа у больных ОНЛЛ с различным иммунофенотипом бластных клеток. Кроме того, были выявлены иммунологические маркеры, влияющие на отдаленные результаты лечения. Частота экспрессии различных антигенов на поверхности лейкемических клеток и достоверность их влияния на частоту достижения ПР, БРВ и ОВ представлены в табл. 4.

Рис. 1. Общая выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD10 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Напротив, присутствие на бластных клетках миелоидного антигена CD13 ассоциировалось с низкой вероятностью достижения ремиссии (41,7% против 74,2% ПР в CD13–негативной группе; р = 0,07) и, как следствие, со значительно более низкой выживаемостью (медиана 5 ме. против 13 мес соответственно; р = 0,06). Подобные данные есть в литературе [16]. Кроме того, наличие маркера CD13 в иммунофенотипе коррелировало с высоким показателем лейкоцитов в дебюте заболевания. Все случаи ОНЛЛ, сопровождавшиеся экспрессией CD13, характеризовались уровнем лейкоцитов свыше 50 тыс в 1 мкл крови, в то время как при отсутствии этого маркера исходный средний уровень лейкоцитов был в среднем в 2,5 раза ниже (58,8±3,07 тыс/мкл против 23,5± 6,29 тыс/мкл соответственно; р = 0,048). По–видимому, опухолевый клон клеток, характеризующийся экспрессий CD13, обладает высоким пролиферативным потенциалом и крайней агрессивностью течения. Однако значение экспрессии антигена CD13 нельзя считать окончательно установленным. Для более весомого заключения о роли данного маркера нужны дополнительные исследования.

Рис. 2. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD7 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Установление экспрессии антигена CD34 позволяет диагностировать особую подгруппу ОНЛЛ, в которой злокачественная трансформация произошла на уровне полипотентной стволовой клетки. Как видно из рис. 3, экспрессия данного маркера на лейкемических бластах была статистически достоверно связана с более короткой продолжительностью ПР. Так, у больных с наличием маркера CD34 в иммунофенотипе медиана продолжительности ПР составила 10 мес. Ни у кого из больных длительность ремиссии не превысила 12 мес. В то же время в группе больных, на бластных клетках которых отсутствовала экспрессия стволовоклеточного антигена, медиана продолжительности ПР составила 17 мес; 2 года и более без рецидива прожили более 40% больных (р = 0,01). Кроме того, обнаружение CD34 антигена на мембране бластных клеток связано с более низкой частотой ремиссии (42,9%) по сравнению с CD34–негативными случаями (67,2%). Видимо, малочисленность CD34+ группы является причиной того, что выраженные различия в частоте получения ремиссий не являются статистически значимыми. Необходимо отметить, что в группе больных, лейкемические клетки которых экспрессировали стволовоклеточный антиген, отмечался более молодой возраст (30,3±7,2 лет против 40,1±2,3 лет соответственно; р = 0,3) и отсутствие экстрамедуллярных проявлений заболевания, в то время как у 8 (25,8%) из 31 CD34–негативных пациентов такие проявления были; различий по другим клиническим и гематологическим показателям отмечено не было (р > 0,95).

Рис. 3. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD34 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Вопрос о прогностической роли эритроидных антигенов крайне затруднительный. Это объясняется тем, что в зарубежных клиниках гликофорин А (отечественные мкАТ – НАЕ–3) исследуется только по показаниям (для дифференциальной диагностики М6 ОНЛЛ), а экспрессия антигена эритробластов (мкАТ – НАЕ–9) не изучается (эти мкАТ получены в лаборатории акад. Г.И.Абелева РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и используются только в нашей стране). Поэтому вопрос о прогностической значимости эритроидных антигенов во многом остается открытым. В нашем наблюдении экспрессия бластными клетками гликофорина А была ассоциирована с более короткой продолжительностью ПР (медиана 1,5 мес против 16 мес; р = 0,02). Данный антиген был изучен у 44 больных и в 3–х случаях он был позитивным, что составляет 7% и соответствует частоте встречаемости острого эритробластного лейкоза, для которого он является патогномоничным. В наших более ранних исследованиях негативное влияние на БРВ обоих эритроидных маркеров оказалось взаимодополняющим [1]. Несомненно, для окончательного заключения требуется дополнительный набор материала. Однако полученная даже на небольшой выборке достоверная корреляция свидетельствует о недостаточности стандартной цитозар–антрациклиновой терапии для лечения больных с М6 вариантом ОНЛЛ.

Как видно из изложенных выше данных, нами установлен ряд факторов, ассоциированных с продолжительностью болезни и ремиссии у больных ОНЛЛ, проанализированных без учета используемого антрациклинового производного. Располагая достаточно большим клиническим материалом, накопленным за 15 лет наблюдения, в течение которых в отделении химиотерапии гемобластозов РОНЦ РАМН использовались 4 программы химиотерапии, и, принимая во внимание то, что отдельные иммунофенотипы ОНЛЛ могут иметь особенности в чувствительности к различным антрациклинам, мы попытались провести сравнительное изучение влияния иммунологического фенотипа на результаты лечения в пределах отдельных программ.

Как нами было показано (табл. 3), ни один из клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов не оказывал влияния на прогноз ОНЛЛ в условиях применения программы лечения с включением идарубицина. По этой причине мы остановились именно на данной программе с целью демонстрации возрастающей роли иммунологических факторов прогноза у этих конкретных больных.

При использовании идарубицин–цитарабиновой комбинации, как и при других химиотерапевтических программах, сохранялось негативное прогностическое влияние на ОВ и БРВ экспрессии антигена CD7 (р = 0,03). Кривые выживаемости представлены на рис. 4. Кроме того, обнаружение на опухолевых клетках антигена CD34 ухудшало БРВ, при этом разница приближалась к достоверной (p = 0,06). Но вместе с тем выявились маркеры, присутствие которых при применении идарубицина, в отличие от других антрациклиновых производных, значительно улучшало прогноз.

Рис. 4. Общая (А) и безрецидивная (Б) выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD7 на поверхности бластных клеток при идарубицин-цитарабиновой программе терапии.

При использовании идарубицина отмечался интересный факт: наиболее чувствительными к индукционной терапии были больные с CD38–позитивными бластными клетками. При экспрессии на бластных клетках маркера CD38 частота ПР была более чем вдвое выше, чем при CD38– ОНЛЛ: 68,2% и 33,3% соответственно (р = 0,07). Больные с наличием в иммунофенотипе бластов молекулы CD38 также имели более длительную ПР (рис. 5). Так, 44 и более месяцев без рецидива прожил каждый четвертый больной, на опухолевых клетках которых отмечалась экспрессия CD38 антигена. В то же время длительность безрецидивного периода ни у одного из CD38–негативных больных не превысила 13 меc (р = 0,013).

Рис. 5. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD38 на поверхности бластных клеток при идарубицин-цитарабиновой программе терапии.

Также была отмечена благоприятное прогностическое влияние на ОВ коэкспрессии миелоидных антигенов CD15 и CD33 (медиана 10 мес против 4 мес; р = 0,05) и В–клеточных маркеров CD19 и CD22 (медиана 43 мес против 5 мес; p = 0,032).

Приведенные данные убедительно показывают, что снижение прогностической роли общепринятых клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов в условиях современной химиотерапии ОНЛЛ отнюдь не отражает улучшение прогноза у всех больных. Выделить резистентную или, напротив, более благоприятную в прогностическом плане группу позволяют молекулярно–биологические особенности бластных клеток, установленные методом иммунофенотипирования.

Таким образом, приведенные в нашей статье данные свидетельствуют о том, что иммунологическое исследование является необходимым компонентом первичного обследования больных ОНЛЛ. Помимо изучения чисто клинических аспектов, иммунофенотипирование позволяет глубже понять природу этого заболевания и особенности его течения. Выделение на основании исходных прогностических факторов (включая иммунофенотип) групп больных, имеющих низкую вероятность достижения ремиссии или высокий риск развития рецидива, позволяет индивидуализировать лечение и улучшать его результаты [2]. Это перспективное направление в современной терапии злокачественных новообразований в целом и ОНЛЛ, в частности.

1. Калетин Г.И., Тупицын Н.Н., Волкова М.А. и др. // Новое в онкологии / Под ред. И.В. Поддубной и Н.А.Огнерубова. – Воронеж, 1997. – С. 11–14.

2. Маркина И.Г., Волкова М.А., Тупицын Н.Н. и др. // Новое в онкологии / Под ред. И.В. Поддубной и Н.А.Огнерубова. – Воронеж, 1999. – С. 5–11.

3. Adamczyk–Cioch M.B., Dmoszyncka A., Hus M. et al. // Pol. Arch. Med. Wewn. – 1995. – Vol. 94(1). – P. 40–46.

4. Baer M.R., Stewart C.C., Lawrence D. et al. // Blood. – 1997. – Vol. 90 (4). – P. 1643–1648.

5. Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T. // Ann. Int. Med. – 1985. – Vol. 103 – P. 626–629.

6. Boekhonrst R.A.W., Leeun R., Schoester M. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 82(10). – P. 3157–3162.

7. Bradstock K., Matthews J., Benson E. et al. // Blood. – 1994. – Vol. 84 (4). – P. 1220–1225.

8. Casasnovas R.O., Solary E., Campos L. et al. // Leuk. Lymphoma. –1994. – Vol. 13(1). – P. 109.

9. Cuneo A., Fagioli F., Passi I. et al. // Leuk. Res. – 1992. –Vol. 16 (8). – P. 789–796.

10. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. // Leuk. Lymphoma. – 1995. – Vol. 17(2). – P. 111–119.

11. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. // Leukemia. – 1994. – Vol. 8(3). – P. 388–394.

12. Greaves M.F. // Cancer Surveys. – 1982. – Vol.1(2). – P.189–204.

13. Guinot M., Sans G.F., Sempere A. et al. // Br. J. Haematol. – 1991. – Vol. 78. – P. 533–534.

14. Haynes B.F., Martin M.E., Kay H.H. et al. // J. Exp. Med. – 1988. – Vol. 168. – P. 1061–1080.

15. Kita K., Miwa H., Nakase K. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 81(9). – P. 2399–2405.

16. Kristensen J.S., Hokland R. // Leuk. Res. – 1991. – Vol. 15 (8). – P. 693–700.

17. Kurtzberg J., Denning S.M., Nycum L.M et al. // Proc. Natl. Acad .Sci. USA. – 1989. – Vol. 86. – P. 7575–7579.

18. Lanza F., Rigolin G.M., Moretti S. et al. // Leuk. Lymphoma. – 1994. – Vol. 13. – P. 81–85.

19. Lowenberg B., Downing J.R., Burnett A. // New England J. Med. – 1999. – Vol. 341(14). – P. 1051–1062.

20. Paietta E., Andersen J., Yunis J. et al. // Br. J. Haematol.. – 1998. – Vol. 100(2). – P. 265–272.

21. Reading C.L., Estey E.H., Huh Y.O. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 81. – P. 3083–3090.

22. Robertson M.J., Ritz J. // Blood. – 1990. – Vol. 76. – P. 2421–2438.

23. Venditti A., Del Poeta G., Buccisano F. et al. // Leukemia. – 1998. – Vol. 12. – P. 1056–1063.

Читайте также: