Ранняя диагностика рака патенты

Описание патента на изобретение RU2321854C2

Настоящее изобретение относится к медицине, а именно к онкоурологии, и может быть использовано при ранней диагностике больных раком предстательной железы с целью улучшения эффективности проводимой терапии.

Известно, что с целью скрининга рака предстательной железы наряду с инструментальными методами используют и определение уровня концентрации простатического специфического антигена в сыворотке крови. Уровень концентрации простатического специфического антигена в сыворотке крови более 4 нг/мл является подозрительным в отношении наличия рака предстательной железы (Catalona W.J., Partin A.W., Slawin К.М., Brawer М.К., Flanigan R.С., Patel., Richie J.P., deKernion J.В., Walsh P.С., Scardino P.Т., Lange P.H., Subong E.N., Parson R.E., Gasior G.Н., Loveland К.G., Southwick P.С. Use of the percentage of free prostate-specific antigen to enhance differentiation of prostate cancer from benign prostatic disease: a prospective multicenter clinical trial. J. Am. Med. Assoc., 279: 1542-1547, 1998).

Новым подходом в диагностике заболеваний предстательной железы стало открытие молекулярных форм простатического специфического антигена. В настоящее время наиболее часто используемой молекулярной формой простатического специфического антигена является соотношение свободного простатического специфического антигена к общему. Несмотря на то что внедрение в урологическую практику вышеуказанных вариантов и молекулярных форм простатического специфического антигена значительно улучшило диагностику и дифференциальную диагностику рака предстательной железы, тем не менее, встречаются клинические ситуации, когда это заболевание на ранних стадиях остается не диагностированным.

В последнее время в литературе появились данные об использовании другой молекулярной формы простатического, специфического антигена - комплекс простатического специфического антигена с α1-антихимотрипсином.

Известно, что секреция α1-антихимотрипсина усиливается в раковых клетках предстательной железы, в то время как в нормальных клетках предстательной железы синтез α1-антихимотрипсина минимален (Oremek G.M., Sapoutzis N., Eden F. Complexed PSA in routine diagnosis. Anticancer Res. 2003. - 23. - 975-977. №13).

Несмотря на то что использование показателя соотношения свободного простатического специфического антигена к общему или комплексного простатического специфического антигена в диагностике рака предстательной железы дает высокие результаты, в литературе описано, когда в этих случаях данное соотношение превышает 15%, и при этом по результатам гистологического исследования выявляют рак предстательной железы. Это связано с тем, что в первом случае свободный простатический специфический антиген в сыворотке крови не стабилен и подвергается денатурации под воздействием различных факторов, что приводит к снижению его концентрации в сыворотке крови и в конечном итоге приводит к ошибке при его количественном определении, а во втором случае комплексный простатический специфический антиген составляет большую часть от общего простатического специфического антигена, что, в свою очередь, снижает вероятность диагностической ошибки при его количественном определении в сыворотке крови. Так как молекула комплексного простатического специфического антигена более стабильна при воздействии различных факторов по сравнению с молекулой свободного простатического специфического антигена, однако его специфичность также ограничена и имеется вероятность ошибки, особенно на раннем этапе развития злокачественного заболевания.

Целью настоящего изобретения стала разработка алгоритма дифференциальной диагностики рака предстательной железы, позволившая повысить точность дифференциации до 89%, при этом диагностика осуществлялась на более раннем этапе, что позволило своевременно назначить адекватную терапию и значительно улучшить отдаленные результаты проводимого лечения. Кроме того, данный способ может быть использован в профилактическом направлении, при массовом скрининге мужчин в возрасте после 50 лет, тем более что в настоящее время известно, что частота рака предстательной железы неуклонно растет по мере увеличения возраста. Исследователи считают, что латентные, доклинические формы рака предстательной железы имеют 80-90% мужчин в возрасте 80 лет.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом:

У мужчины в возрасте старше 50 лет определяется уровень концентрации общего простатического специфического антигена в сыворотке крови и количество лейкоцитов в секрете простаты. Больному забирается кровь в объеме 5 мл из вены. Кровь центрифугируется до получения сыворотки. В сыворотке крови определяется общий простатический специфический антиген (ОПСА). Секрет забирается после массажа предстательной железы, после чего в нем определяют количество лейкоцитов. При значении ОПСА более 4 нг/мл и количестве лейкоцитов в секрете более 20 в поле зрения назначается этиотропное лечение. Затем вновь определяют уровень ОПСА, и, если его значение также более 4 нг/мл, определяют объем предстательной железы и при его значении более 50 см 3 определяют уровень комплексного простатического специфического антигена (кПСА), и при его значении более 3,6 нг/мл диагностируют рак предстательной железы, а при значении кПСА менее 3,6 нг/мл - отсутствие злокачественной природы заболевания. В случаях когда ОПСА меньше 30 нг/мл и количество лейкоцитов менее 20 в поле зрения, пациенту определяют объем предстательной железы, и, если он более 50 см 3 , определяют кПСА, и при его значении менее 3,6 нг/мл осуществляют динамическое наблюдение, как и в случае значений ОПСА менее 4 нг/мл после проведенного этиотропного лечения.

Клинический пример №1.

При диспансерном обследовании у пациента В. 57 лет (история болезни №14382), в отсутствие каких-либо жалоб, была взята кровь для определения простатического специфического антигена, уровень которого составил 5,8 нг/мл. В секрете предстательной железы лейкоциты составили 25 в поле зрения. После проведения курса этиотропной терапии уровень общего простатического специфического антигена в сыворотке крови составил 5,2 нг/мл. По данным УЗИ объем предстательной железы составил 62 см 3 . Соотношение свободного простатического специфического антигена к общему составило 20%, что не говорит в пользу рака предстательной железы. Комплексный простатический специфический антиген составил 4 нг/мл. При проведении биопсии обнаружена аденокарцинома предстательной железы. После стадирования заболевания стадия у данного больного составила T1cNoMo, что позволило выполнить пациенту радикальную простатэктомию и полностью излечить данного пациента.

Клинический пример №2.

Больной М. 57 лет (история болезни №1563), при диспансерном обследовании общий простатический специфический антиген в сыворотке крови составил 4,4 нг/мл, по данным УЗИ нет данных за наличие рака предстательной железы. В секрете предстательной железы лейкоциты составили 40-50 в поле зрения. После проведения курса этиотропной терапии уровень общего простатического специфического антигена в сыворотке крови составил 5,2 нг/мл. По данным УЗИ объем предстательной железы составил 58 см 3 . При определении комплексного простатического специфического антигена оказалось, что комплексный простатический специфический антиген составил 4,8 нг/мл, что подтверждает наличие злокачественного процесса. При проведении биопсии предстательной железы обнаружена аденокарцинома предстательной железы.

Клинический пример №3.

У больного С. 69 лет (история болезни №16589) уровень общего простатического специфического антигена составил 6,2 нг/мл. В секрете предстательной железы лейкоциты составили 30-40 в поле зрения. После проведения курса этиотропной терапии уровень общего простатического специфического антигена в сыворотке крови составил 4,3 нг/мл. По данным УЗИ объем предстательной железы составил 42 см 3 , данных за наличие злокачественной опухоли получено не было. Показатель соотношения свободного простатического специфического антигена к общему составил 18%, что не говорит в пользу рака предстательной железы. Комплексный простатический специфический антиген составил 3,2 нг/мл, что говорило об отсутствии злокачественного процесса. При проведении биопсии была обнаружена доброкачественная гиперплазия простаты.

Клинический пример №4.

У больного К. 70 лет (история болезни №12461) по данным УЗИ обнаружена доброкачественная гиперплазия предстательной железы, общий простатический специфический антиген в сыворотке крови составил 5,8 нг/мл. В секрете предстательной железы лейкоциты составили 10 в поле зрения. По данным УЗИ объем предстательной железы составил 48 см 3 , данных за наличие злокачественной опухоли получено не было. Показатель соотношения свободного простатического специфического антигена к общему составил 18%, что не говорит в пользу рака предстательной железы. Был определен уровень комплексного простатического специфического антигена, который составил 4,2 нг/мл. При гистологическом исследовании обнаружена аденокарцинома предстательной железы.

Таким образом, был разработан способ интерпретации показателей простатического специфического антигена, его молекулярных форм, с внедрением новой молекулярной формы - комплексного простатического специфического антигена. Использование данного алгоритма позволяет улучшить диагностику рака предстательной железы у больных с уровнем общего простатического специфического антигена от 4 до 10 нг/мл и его дифференциальную диагностику с другими заболеваниями предстательной железы, а также позволяет проводить массовое обследование мужчин после 50 лет с целью выявления рака предстательной железы на его ранних стадиях, что значительно улучшает качество лечения данного злокачественного заболевания.

В настоящее время этот способ применяется в урологической клинике ГОУ ВПО РГМУ Росздрава на базе урологического отделения 1-й городской клинической больницы им. Н.И. Пирогова г. Москвы. С использованием данного способа обследовано более 200 мужчин с подозрением на рак предстательной железы, основанного на повышении уровня общего простатического специфического антигена в интервале от 4 до 10 нг мл, в отсутствие у них каких-либо активных жалоб, из них у 42 был выявлен рак предстательной железы на его ранних стадиях, что позволило провести данным пациентам радикальное оперативное лечение с хорошими отдаленными результатами.

Заявленное изобретение, несмотря на кажущуюся простоту, не очевидно для специалистов, работающих в данной области.

Заявленное изобретение имеет важное социально-экономическое значение и позволяет качественно осуществлять диспансеризацию мужчин старше 50 лет, как в условиях поликлиники, так и в условиях стационара.

Реферат патента 2008 года СПОСОБ РАННЕЙ ДИАГНОСТИКИ РАКА ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ

Изобретение относится к области медицины, а именно к онкоурологии. Ранняя диагностика рака предстательной железы от заболеваний незлокачественной природы включает в себя ультразвуковое исследование предстательной железы, определение уровня концентрации простатического специфического антигена в сыворотке крови, уровня общего простатического специфического антигена (ОПСА) и количества лейкоцитов в секрете предстательной железы. При значении первого показателя более 4 нг/мл, а второго более 20 лейкоцитов в поле зрения назначают этиотропное лечение. Затем вновь определяют уровень ОПСА. При наличии значения его уровня более 4 нг/мл определяют объем предстательной железы, при его значении более 50 см 3 определяют уровень комплексного простатического специфического антигена (кПСА). И при его значении более 3,6 нг/мл диагностируют рак предстательной железы, а при значении кПСА менее 3,6 нг/мл - отсутствие злокачественной природы заболевания. Способ позволяет улучшить диагностику рака предстательной железы. 1 ил.

Формула изобретения RU 2 321 854 C2

Способ ранней диагностики рака предстательной железы от заболеваний незлокачественной природы, включающий в себя ультразвуковое исследование предстательной железы, определение уровня концентрации простатического специфического антигена в сыворотке крови, отличающийся тем, что определяют уровень общего простатического специфического антигена (ОПСА) и количество лейкоцитов в секрете предстательной железы и при значении первого показателя более 4 нг/мл, а второго более 20 лейкоцитов в поле зрения назначают этиотропное лечение, после которого вновь определяют уровень ОПСА, при наличии значения его уровня более 4 нг/мл определяют объем предстательной железы, при его значении более 50 см 3 определяют уровень комплексного простатического специфического антигена (кПСА) и при его значении более 3,6 нг/мл диагностируют рак предстательной железы, а при значении кПСА менее 3,6 нг/мл отсутствие злокачественной природы заболевания.

Патент 2204835

Диагностика рака желудка на ранней стадии

Изобретение относится к области медицины, в частности к онкологии. Способ и диагностические наборы обеспечивают выявление рака желудка в предраковой фазе с высокой точностью. Выявляют гистологически повышенный риск развития рака желудка путем исследования образца, взятого у пациента и включающего клетки слизистой желудка и предраковых повреждений при карциноме желудка. Определяют в них экспрессию мРНК циклооксигеназы-2 (ЦОКС-2) или белка ЦОКС-2 и на повышенный риск развития рака желудка указывают высокие уровни данной экспрессии по сравнению с контрольными образцами. Диагностические наборы содержат в одном случае реагенты для выделения РНК или поли-А+мРНК, специфические праймеры Цокс-2 для ОТ-ПЦР и фрагменты кДНК для изготовления пробных ДНК или РНК, а в другом специфичные в отношении Цокс-2 поликлональные или моноклональные антитела, специфические пептиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2, или олигонуклеотиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2. 3 с. и 3 з.п. ф-лы, 1 табл., 11 ил.

Область изобретения Настоящее изобретение относится к диагностике рака желудка и заключается в специфичном способе выявления рака желудка в предраковой фазе посредством определения экспрессии циклооксигеназы-2 в образце, взятом у пациента.

Предпосылки к созданию изобретения Рак желудка является наиболее распространенным и чаще всего приводящим к летальному исходу злокачественным новообразованием в мире (Coleman et al., 1993). По частоте он находится на четвертом месте среди наиболее распространенных злокачественных новообразований у жителей Финляндии мужского пола и на пятом - женщин и составляет 5% от всех злокачественных новообразований в Финляндии (Cancer Incidence in Finland 1994. Finnish Cancer Registry, Helsinki, 1996). Раннее выявление рака желудка является сложной задачей, и в большинстве стран Запада пятилетняя выживаемость составляет менее 20% (Wanebo et al., 1993). Более 90% раковых опухолей желудка представляют из себя аденокарциномы, которые делят на интестинальный и диффузный типы по классификации Lauren (Lauren, 1965).

Патогенез рака желудка сложен и не до конца ясен, однако в случае интестинального типа с этим заболеванием связаны определенные предшествующие изменения, такие как хронический атрофический гастрит, интестинальная метаплазия и дисплазия эпителия (Antonioli, 1994). Напротив, в случае диффузного типа хорошо известные предшествующие повреждения отсутствуют. Поскольку в этих двух гистологически различимых типах рака желудка были обнаружены различные комбинации генетических изменений, они могут обладать и различными генетическими предпосылками (Stemmermann et al., 1994; Tahara et al., 1996). Однако связанные со злокачественными процессами генетические изменения, которые являются общими для этих двух типов аденокарциномы желудка, как представляется, могут быть выявлены уже на предраковой стадии болезни (Tahara et al., 1996).

Недавние исследования наводят на мысль о том, что Цокс-2 имеет отношение к канцерогенезу в толстом кишечнике и может являться, таким образом, мишенью химиопрофилактического эффекта НПВП: 1) генетическое разрушение гена Цокс-2 или лечение специфическим препаратом Цокс-2 подавляет образование полипов у подопытных мышей с FAP (семейный аденоматозный полиноз) (Oshima et al., 1996), 2) избыточная экспрессия Цокс-2 клетками кишечного эпителия у крыс изменяет скорость наступления запрограммированной гибели клеток и их адгезию к внеклеточному матриксу (Tsujii et а1., 1995), а также 3) два различных селективных ингибитора Цокс-2 подавляют химически индуцированные аберрантные очаги на криптах толстого кишечника у крыс (Takabashi et al., 1996; Ready et al. , 1996). Помимо этого, в тканях карциномы толстого кишечника, индуцированной химическим путем, обнаружены повышенные уровни мРНК и белка Цокс-2, но не Цокс-1 (DuBois et а1., 1996), а также в тканях карциномы толстого кишечника человека по сравнению с нормальной слизистой оболочкой (Eberhart et al., 1994; Kargman et al., 1995; Sano et al., 1995).

Идея о том, что химиопрофилактический эффект НПВП нацелен против Цокс-2, дополнительно подтверждается тем, что соединения, селективно ингибирующие Цокс-2, подавляют пролиферацию клеток кишечного эпителия у крыс, а также клетки эпителия молочной железы, в которых экспрессия Цокс-2 была индуцирована онкогенами (Sheng et al., 1997 и Subbaramaiah et al., 1996). Также Tsujii et al. (1996) недавно сообщили о том, что специфический ингибитор Цокс-2 подавляет пролиферацию клеточной линии карциномы желудка и толстого кишечника, которая экспрессирует стабильно высокие уровни мРНК Цокс-2. Это не имело место в клеточных линиях, которые экспрессируют низкие уровни мРНК Цокс-2.

Нормальные ткани желудочно-кишечного тракта содержат почти исключительно изоформу Цокс-1, и в здоровых тканях желудка не было выявлено функционального белка Цокс-2 (Kargman et al., 1996). Некоторое количество мРНК Цокс-2, однако, можно обнаружить более чувствительными методами, чем традиционный гибридизационный анализ общей РНК посредством нозерн-блоттинга, например, с помощью ОТ-ПЦР (см. O'Neill and Ford-Hutchinson 1993, а также фиг.1 и 4 настоящей работы).

Описание изобретения Поскольку неизвестно, присутствует ли Цокс-2 в тканях карциномы желудка in vivo или в ее предраковых повреждениях, авторы изучали ее экспрессию в аденокарциномах желудка, а также в тяжелых дисплазиях желудка (которые с высокой степенью вероятности являются предраковыми). Авторы обнаружили повышенные уровни мРНК Цокс-2, но не Цокс-1, в тканях аденокарциномы желудка человека и при тяжелых дисплазиях желудка. Однако экспрессия Цокс-2 не была повышена при легких степенях дисплазии, которые редко переходят в злокачественное развитие. При карциноме желудка белок Цокс-2 локализовался прежде всего в раковых клетках.

Повышенная экспрессия Цокс-2 не ограничивалась интестинальным типом, поскольку каждая из изучавшихся трех диффузных карцином содержала более высокие уровни мРНК Цокс-2 по сравнению со своими контролями. Таким образом, чрезмерная экспрессия Цокс-2 представляет из себя одну из характеристик, общих для этих двух гистологически и генетически различных заболеваний, что может свидетельствовать в пользу ее участия в ранней фазе канцерогенеза. В самом деле, авторы обнаружили, что Цокс-2 экспрессируется в тяжелых дисплазиях желудка, в то время как в дисплазиях легкой степени эта экспрессия не увеличена. Это наводит на мысль о том, что в случае карциномы желудка экспрессия Цокс-2 может быть специфически связана с предраковыми повреждениями.

Экспрессия Цокс-2 в раковых опухолях человека, как представляется, по крайней мере, в настоящее время, ограничивается желудочно-кишечным трактом. Однако, поскольку рак толстого кишечника и рак желудка являются эпидемиологически, морфологически и генетически разными заболеваниями, тот факт, что повышенные уровни мРНК и белка Цокс-2 были обнаружены в тканях рака толстого кишечника грызунов и человека, никак не проясняет той роли, которую они играют в тканях желудка. Тот факт, что одна клеточная линия карциномы желудка, как было показано, экспрессирует стабильно высокие уровни мРНК Цокс-2, также не указывает на ее роль при ранних стадиях рака желудка in vivo.

Целью настоящего изобретения является разработка способа диагностики рака желудка на ранней стадии, который включает выявление мРНК Цокс-2 или белка Цокс-2 в соответствующих образцах, взятых у пациента. Этот метод основан на установленном авторами факте повышенной экспрессии Цокс-2 в клетках раковых опухолей желудка и в предраковых повреждениях, но в очень низкой или вообще не определяемой ее экспрессии в нормальных тканях желудка.

Взятые у пациентов образцы, которые подвергаются исследованию, например материалы биопсии или соскобы, являются материалами, которые получают во время обычной гастроскопии или промывания желудка в сочетании с соскобом. Промывание желудка и взятие соскобов являются хорошо известными способами обычного цитологического исследования желудка. Эти способы позволяют взять образцы клеток со слизистой оболочки желудка для микроскопического исследования с целью установить или исключить наличие злокачественного процесса в желудке. Маркеры, такие как Цокс-2, могут повысить чувствительность и специфичность этого исследования по сравнению с существующим в настоящее время способом прямой визуализации морфологии клеток. Биоптаты, взятые при гастроскопии, или фиксируют в формалине (для иммуногистохимического анализа), или замораживают в жидком азоте и хранят при -70 o С (для анализа мРНК).

мРНК Цокс-2 удобно выявлять в указанных образцах, взятых у пациента, с помощью известных методик. Например, анализ Норзерн-блоттинг, как было показано авторами, является чрезвычайно специфичным и в сочетании с ОТ-ПЦР также весьма чувствительным.

Выявление белка Цокс-2 удобно выполнять в указанных образцах, взятых у пациента, с помощью, например, иммуногистохимического исследования, которое, кроме выявления экспрессии Цокс-2, указывает также локализацию этого белка.

Набор для иммунологического выявления белка Цокс-2 включает специфичные в отношении Цокс-2 поликлональные или моноклональные антитела. Для анализа на основе пептидов белка Цокс-2 разработан диагностический набор, который включает специфические пептиды, обладающие связывающим сродством к Цокс-2. Указанные пептиды можно получить, например, из коллекций фагов. Также можно выполнять анализы с использованием олигонуклеотидов, в которые включены олигонуклеотиды (модифицированные молекулы РНК) в составе соответствующего диагностического набора.

Краткое описание чертежей Фиг. 1А. Нозерн-блот гибридизационный анализ общей РНК, экстрагированной из образцов карциномы желудка 1-11 и из их парных контрольных образцов, не содержавших раковых клеток ((а - полость (антрум); с - тело). Гибридизация выполнялась с пробами для Цокс-1 и Цокс-2 человека, а также с ГАФДГ в качестве нагрузочного контроля.

Фиг.1В. Показано соотношение мРНК Цокс-2 и мРНК ГАФДГ. Величины (средние СКО среднего) на графиках представляют собой соотношение мРНК Цокс-2 и мРНК ГАФДГ, рассчитанное с помощью стандартных денситометрических единиц, и показывают, что ткани карциномы желудка экспрессируют значительно более высокие уровни мРНК Цокс-2, чем контрольные образцы (Р o С. Один образец карциномы желудка из-за сильного аутолиза при гистологическом исследовании был исключен из анализа. В случае карциномы желудка парные образцы слизистой оболочки желудка, которые не содержали ни макроскопической опухолевой ткани, ни гистологически различимых раковых клеток, получали из антрума (n=10) и тела (n=10) желудка. Все формы рака желудка представляли собой, в основном, аденокарциномы, из которых восемь представляли собой интестинальный и три-диффузный тип (Lauren, 1965) по определению названного здесь патолога.

Выделение РНК и нозерн-блот анализ Общую РНК выделяли с помощью методики Chomczynski и Sacchi (1987) с использованием реагента RNAzol TM В (Tel-Test, Friendswood, TX) и ее количество определяли поглощением при 260 нм. Образцы РНК (15 мкг) денатурировали в 1М глиоксале, 50% диметилсульфоксиде и 10 мМ фосфатном буфере при 50 o С в течение 60 мин, подвергали электрофорезу на 1,2% геле агарозы и переносили на нейлоновые мембраны Hybond-N (Amersham International, Aulesbury, UK), которые затем облучали УФ в течение 6 мин с помощью УФ прибора Reprostar II (Camag, Muttenz, Switzerland). Фрагменты очищенной человеческой кДНК Цокс-1 ORF (1,8 тыс. осн.), Цокс-2 ORF (1,8 тыс. осн.) и глицеральдегид-3-фосфат дегидрогеназы (ГАФДГ, 0,8 тыс. осн.) метили с помощью [ 32 P]--dCTP (3000 Ки/ммоль, DuPont, New England Nuclear, Boston, MA) и набора Prime-a-Gene (Promega, Madison, WI). Пробы очищали на ник-колонках (Pharmacia, Uppsala, Sweden) и использовали при 110 6 имп. /мин/мл в гибридизационном растворе, содержавшем 50% формамида, 6SSC (1SSC=0,15 М NaCl и 0,015 М цитрат Na, pH 7,0), 0,1% Ficoll, 0,1% поливинилпирролидона, 0,1% сывороточного альбумина крупного рогатого скота, 100 мкг/мл ДНК молок сельдевых рыб, 100 мкг/мл РНК дрожжей и 0,5% додецилсульфата натрия (ДСН) при 42 o С в течение 16 ч. Фильтры трижды промывали 0,1-1SSC и 0,1% ДСН при 50 o С. Пробы нозерн блот количественно определяли на приборе FujiFilm IP-Reader Bio-Imaging Analyzer BAS 1500 (Fuji Photo Co., Tokyo, Japan) с помощью программы MacBas, поставляемой производителем, и визуализировали с помощью ауторадиографии.

Полимеразная цепная реакция с обратной транскриптазой (ОТ-ПЦР) Общую РНК (1 мкг) превращали в кДНК на приборе Superscript II (Life Technologies, Gaithersburg, MD) с помощью олиго-dT (Pharzmacia) и случайных гексамеров (Life Technologies). Для получения полуколичественных результатов оптимизировались три параметра: количество циклов, концентрация праймеров и температура гибридизации. кДНК (4 мкл) амплифицировали с помощью ПЦР в 100 мкл реакционной смеси, которая содержала 10 мМ Трис-HCl, рН 8,8, 50 мМ КС1, 0,2 мМ dNTPs, 1,5 мМ MgCl, 0,2 мкг (Цокс-1) или 2 мкг (Цокс-2) чувствительных и античувствительных праймеров (Ristimaki et al., 1994), и 2,5 ЕД ДНК-полимеразы Dynazyme II (Finnzymes, Espoo, Finland). Для эксперимента, указанного на фиг. 2, образцы амплифицировали в течение 30 (Цокс-1) или 32 (Цокс-2) циклов денатурации при 96 o С в течение 1 мин, проводили гибридизацию при 60 o С (Цокс-1) или при 46 o С (Цокс-2) в течение 1 мин и распрямляли при 72 o С в течение 1 мин. Амплифицированные кДНК анализировали с помощью электрофореза на 2% геле агарозы и окрашивания бромидом этидия. Амплифицированные продукты количественно определяли с помощью камеры CCD высокого разрешения (серии Cohu 4910 с чип-интеграцией, Cohu Inc., San Diego, CA) и программы Scion Image 1.57 (Scion Corp., Frederick, MD) на персональном компьютере Макинтош.

Процедуру ОТ-ПЦР для фиг.4А и фиг.4В выполняли, как описано выше. Однако указанные циклы титровали заново; результаты представлены на фиг.4С.

Иммуногистохимический анализ Образцы ткани фиксировали в 10% формалине с нейтральным буфером, заливали в парафин, нарезали (приблизительно 5 мкм), депарафинизировали и подвергали высокочастотному воздействию в течение 15 мин в 0,1 М Na-цитратном буфере (рН 6,0). Срезы затем погружали в 0,6% пероксид водорода на 30 мин, а затем в нормальную козью сыворотку (5%)/сывороточный альбумин крупного рогатого скота (10%) на 1 ч для блокирования активности эндогенной пероксидазы и неспецифических сайтов связывания соответственно. Иммуноокрашивание осуществляли с помощью поликлонального иммуноглобулина G кролика против пептида Цокс-2 мыши (Cayman Chemical Co., Ann Arbor, MI) в разведении 1:300 - 1:600 при 4 o С в течение ночи. Срезы затем обрабатывали биотинилированными вторичными антителами в разведении 1:200 (Vector Laboratories, Burlingame, CA), а участки связывания антител в конечном итоге визуализировали с помощью раствора пероксидазного комплекса авидин-биотин (ABComplex, Vectastain, Vector Laboratories) и 3-амино-9-этилкарбазола (Sigma Chemical Co., St. Louis, МО). Контрастное окрашивание осуществляли с помощью гемалаума Mayer (Merck, Darmstadt, Germany).

Большинство видов рака излечимы, если болезнь была выявлена на начальной стадии и новообразование носит локальный характер. Это значит, что злокачественные клетки еще не распространились с кровью и лимфой в другие органы и системы.

К сожалению, большое количество злокачественных процессов долгое время протекает бессимптомно или с незначительными недомоганиями. Пациенты нередко обращаются за медицинской помощью уже на III или даже IV стадиях, когда прогноз неутешителен, поэтому так важна ранняя диагностика рака.

Когда нужно начинать беспокоиться

Симптомы рака зависят от его вида и локализации (расположения опухоли) и могут существенно отличаться. Однако есть проявления общего плана, которые характерны для злокачественных процессов всех видов:

Слабость, утомляемость, хроническая усталость).
Необъяснимая потеря веса.
Повышение температуры тела.
Бледность кожных покровов.
Потеря аппетита.
Периодически возникающая боль в какой-либо области тела, не имеющая видимой причины.

Возможно беспричинное покашливание, одышка, кровь в кале или моче, появление странных пятен и язв на теле, и так далее – в зависимости от вида заболевания.

Если симптомы не проходят в течение некоторого времени, нужно немедленно обращаться за медицинской помощью.

Методики выявления злокачественных опухолей

Диагностика рака обычно проходит в два этапа – обнаружение неполадок в организме неспецифическими и скрининговыми методами, а затем узконаправленный поиск болезни.

Справка! Неспецифические исследования – результаты которых свидетельствуют о наличии заболевания, но не дают возможности установить точный диагноз. Однако указывают направление для дальнейшего обследования.

Специфические – узконаправленное исследование, которое позволяет выявить вид заболевания и его локализацию в органе.

Анализы крови на онкомаркеры.
Цитологические и гистологические исследования биологического материала.
Рентгенологические исследования конкретных органов (например, маммография, рентген желудка).
Компьютерная томография (КТ), мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ).
Магнитно-резонансная томография (МРТ).
Ультразвуковое исследование (УЗИ).
Эндоскопические методы с взятием образца ткани.

Некоторые виды неспецифических исследований:

Общий анализ крови.
Биохимический анализ крови.
Флюорография.
Общий анализ мочи.
Анализ кала на скрытую кровь.

Женщинам важно проходить ежегодные гинекологические осмотры и пальпацию молочных желез.

Первичные исследования

Его еще называют клиническим или общеклиническим. Это скрининговое исследование, которое дает развернутую общую картину работы организма, наличия в нем воспалений, анемий, нарушений свертываемости крови.

О возможной локальной онкопатологии могут говорить такие изменения показателей:

Увеличение СОЭ (скорость оседания эритроцитов) с нормальным или повышенном значением лейкоцитов (белых кровяных телец).
Падение количества гемоглобина без видимых причин. Может происходить при злокачественных процессах желудка и кишечника.
Одновременное повышение уровня СОЭ, гемоглобина и эритроцитов (красных кровяных телец) может свидетельствовать в пользу рака почек.

Однако, если ОАК показал такие результаты, не следует пугаться. Повторим – это неспецифическое исследование, которое гораздо чаще свидетельствует о других, менее опасных болезнях.

Подозрения на лейкоз устанавливают при таких показателях:

Очень большое или предельно низкое количество лейкоцитов.
Сдвиг лейкоцитарной формулы.
Появление в крови незрелых лейкоцитов.
Повышение СОЭ.
Падение показателей гемоглобина (анемия).
Снижение количества тромбоцитов.

При локализованной онкопатологии (опухоль определенного органа) ОАК может не меняться, особенно на ранней стадии.

Может помочь в диагностике рака мочевыводящих путей: почек, мочевого пузыря, мочеточников. В урине в этом случае будет обнаружена кровь плюс атипичные клетки. Чтобы уточнить диагноз назначается цитологический анализ мочи.

При злокачественных новообразованиях почек и паращитовидной железы наблюдается существенный рост показателя кальция.

При раке печени, почек, поджелудочной железы повышается количество печеночных ферментов.

Изменения количества и соотношения гормонов разных типов могут свидетельствовать в пользу злокачественных заболеваний эндокринной сферы.

Помогает обнаружить рак легких.

Диагностика рака специальными методами

Если жалобы пациента и предварительные исследования дают основания заподозрить онкологию, начинается целенаправленный поиск.

Онкомаркеры – вещества, которые выделяют злокачественные опухоли в процессе своей жизнедеятельности. Специфичность этих анализов может варьироваться как по органам (возможность определить, где именно находится новообразование), так и заболеваниям (какой именно тип рака).

Наличие онкомаркеров не всегда говорит о злокачественности болезни. Поэтому после получения положительного результата по какому-либо из них, обязательно назначают дополнительные обследования.

Чаще всего используются такие тесты:

РЭА (раковоэмбриональный антиген) – применяется в гинекологии для выявления опухолей матки, яичника, молочной железы.
АФП (альфа-фетопротеин) – служит для диагностики карцином, в частности, желудка и кишечника.
СА-125 – используется для ранней диагностики рака яичников, но также и других органов (груди, легких, печени).
СА-15-3 – маркер с относительно невысокой специфичностью по органам. Позволяет заподозрить рак груди, яичников, поджелудочной железы, разных отделов кишечного тракта.
ПСА (простатспецифический антиген) – тест новообразований предстательной железы.
СА-19-9 – служит для распознавания онкологии желудочно-кишечного тракта, и в особенности поджелудочной железы.
СА-242 – маркер высокочувствительный к раку желудка и кишечника.

Эти тесты выполняют также в профилактических целях, если пациент находится в группе риска.

Современная медицина располагает большим количеством неинвазивных и малоинвазивных методов, которые позволяют увидеть даже самые маленькие новообразования в труднодоступных местах.

Рентгенологическая диагностика:

Рентгеноскопия – изображение выводится на экран монитора в режиме реального времени. Позволяет отследить особенности работы органа. Чаще выполняются рентгеноскопические осмотры желудка, кишечника, легких.
Рентгенография – рентгеновский снимок органа. Примером рентгенографического исследования служит маммография (снимок молочной железы).
Компьютерная томография (КТ) – послойные рентгеновские снимки в разных плоскостях. При диагностике новообразования выполняется с введением контрастной жидкости, что дает возможность четко увидеть его контуры.
Мультиспиральная компьютерная томография (МСКТ) – срезы органов выполняются при спиральном вращении рентгеновской трубки и постоянном движении стола, где находится пациент. Высокая разрешающая способность метода, тонкие срезы до 0,5мм, дают возможность обнаружить самые мелкие опухоли недоступные обычному КТ. При этом лучевая нагрузка на пациента не увеличивается.

Магнитно-резонансная томография

Принцип работы такой же, как у рентгеновского КТ – получение послойных изображений органов. Но работает оборудование МРТ на основе электромагнитных волн.

Ультразвуковое исследование

Метод основан на способности ультразвука по разному отражаться от разных тканей и жидких сред. Безболезненное недорогое исследование, которое позволяет выявить патологии большинства органов.

Ограничение методов

Рентгенологическое, магнитно-резонансное или ультразвуковое исследования дают возможность увидеть наличие опухоли, оценить ее форму размер и локализацию. Но, чтобы судить о злокачественном или доброкачественном ее характере нужен образец ее ткани, который можно взять только при эндоскопическом исследовании или в ходе хирургической операции.

Это исследование, выполняемое при помощи оптического прибора, который вводится внутрь полого органа или в ходе операции (лапароскопия). При помощи эндоскопа можно осмотреть состояние его стенок, удалить подозрительное новообразование или взять биологический образец для проведения цитологического или гистологического анализа.

К эндоскопической технике относятся:

лапароскопия;
гастроскопия;
гистероскопия;
колоноскопия;
бронхоскопия и т. д.

Если при эндоскопической процедуре была проведена операция или обнаружены подозрительные участки тканей, образец обязательно направляется на цитологическое или гистологическое исследование.

Гистологическое исследование – это изучение строения ткани под микроскопом, а цитологическое — клетки.

По результату этих анализов можно обнаружить наличие клеток с атипичной структурой, выявить их озлокачествление, определить вид и стадию опухоли. Цитологический анализ выполняется быстро, и его обычно используют в качестве скрининга. Для цитологии делают соскобы со слизистой оболочки органов (например, шейки матки), берут аспираты (жидкости), выполняют пункции лимфатических узлов, биопсии молочной и щитовидной желез.

Для проведения гистологии нужно больше времени и более сложное оборудование, но именно ее результат становится основанием для постановки окончательного диагноза.

Существует метод иммуногистохимии, который основан на связывании помещенных в образец ткани антител с соответствующими антигенами. Это очень информативный анализ, который способен выявлять недифференцируемые опухоли, метастазы из невыявленного первичного очага, а также прогнозировать дальнейшее развитие злокачественного процесса. Лабораторное оборудование для иммуногистохимии дорогое, поэтому возможность ее проведения существует не во всех клиниках.

Выявление рака различных органов

Выше были описаны способы, которые применяются при диагностике злокачественных заболеваний всех видов. Но каждый тип онкопатологии имеет свою специфику и локализацию, поэтому инструменты и методы их диагностики будут различаться. Ознакомимся с некоторыми из них.

Занимает первое место, как по распространению среди населения России, так и по смертности. Прогрессирует быстро, склонен к возникновению ранних метастаз.

Существует два вида этой болезни. Центральная, которая развивается в крупных бронхах, и периферическая – локализуется в бронхиолах и паренхиме легких. Симптомы центрального вида рака легких проявляются уже на ранних стадиях из-за уменьшения просвета бронхов, поэтому он достаточно хорошо диагностируется. А периферический тип долгое время протекает бессимптомно, и нередко выявляется на поздней стадии.

Техники определения рака легких:

Общеклинический анализ крови.
Флюорограмма.
Бронхоскопия с биопсией.
МРТ легких.
Плевроцентез с биопсией плеврального выпота.
Торакоскопия с забором материала.
Торакотомия с взятием образца ткани из основного новообразования и близлежащих лимфатических узлов. Это хирургическая операция, к которой прибегают в крайнем случае.

Широко применяются рентгенологические исследования. Но при периферическом раке они нередко выявляют болезнь уже на III–IV стадиях.

Может поражать женщин любого возраста, но гораздо чаще он встречается у пациенток после 40 лет и старше. При его выявлении на I–II стадиях возможно органосохраняющее лечение.

Для ранней диагностики рака молочной железы ежегодно нужно посещать гинеколога или онколога-маммолога. Выполнять профилактическую маммографию необходимо после 40 лет – раз в 2 года, после 50 – 1 раз в год. Более молодым женщинам рекомендовано регулярно проходить УЗИ молочной железы.

Каждая женщина должна периодически выполнять самообследование – это делается стоя перед зеркалом, а потом в положении лежа. Насторожить должно изменение формы груди, появление выделений из соска, пальпация уплотнений, изменение внешнего вида и структуры кожи груди.

Если первичная диагностика дает основание заподозрить рак груди, выполняются такие обследования:

Анализ крови на онкомаркер СА-15-3 и уровень эстрогенов.
КТ и МРТ груди.
Маммография с введением в молочные протоки контрастного вещества (дуктография).
Пункция молочной железы с цитологическим или гистологическим анализом.

В крупных онкологческих центах возможно выявление онкогенных мутаций, методами молекулярной генетики. Женщинам из группы риска есть смысл выполнить такой анализ.

Если человека беспокоят тошнота, рвота, схваткообразные боли в животе, кишечные колики, вздутие живота, запоры или поносы, недержание газов и кала, кровь и гной в кале – есть вероятность злокачественного процесса в кишечнике. Для его диагностики назначают такие процедуры:

УЗИ органов брюшной полости.
Анализ кала на скрытую кровь.
Тест крови на онкомаркер СА-19-9.

Опухоль может быть локализована в разных отделах кишечника.

Для обследования прямой кишки применяют ректороманоскопию. Этот способ позволяет увидеть участок протяженностью до 25 см, что существенно сокращает возможности метода.

Толстый кишечник диагностируют двумя способами – ирригоскопией и колоноскопией.

Ирригоскопия – рентгенография кишечника с применением контрастного вещества (барий).

Колоноскопия – эндоскопическая процедура осмотра стенок органа при помощи гибкой трубки с оптическим прибором.

Ирригоскопия переносится легче колоноскопии, но последняя позволяет выполнить биопсию. В нашей клинике есть возможность провести это исследование под наркозом.

Для уточнения локализации процесса и наличия метастаз может быть назначены ПЭТ-КТ и МРТ.

Как правило, выявляется на поздней стадии. Его ранние симптомы довольно смазаны – умеренные боли в животе, потеря веса, бледность кожных покровов. Обычно это списывают на проявления панкреатита или нарушения питания. Изменения биохимических показателей умеренны, онкологический маркер СА-19-9 на начальной стадии может не повыситься.

Для первичной диагностики используют УЗИ, КТ, МРТ поджелудочной железы.

Чтобы взять образец ткани, используют такие инструменты:

Жалобы на боли в области эпигастрия, стул и рвоту с кровью, тошноту, изжогу, отрыжку, потерю веса, могут свидетельствовать, как о язвенной болезни желудка, так и о раковой опухоли. В этом случае назначается:

Если у пациента были найдены бактерии Helicobacter pylori, это помещает его в зону риска по болезням желудка (гастриты, язва, рак). В этом случае требуется обязательное лечения антибиотиками, а также более тщательный контроль состояния ЖКТ.

Подавляющее большинство злокачественных заболеваний женской половой сферы протекает бессимптомно или с незначительными симптомами вплоть до поздних стадий. Поэтому их профилактика начинается с ежегодного гинекологического осмотра, независимо от наличия жалоб.

Обязательное первичное обследование – осмотр в кресле гинеколога с зеркалами. По его результатам врач предпринимает дальнейшие действия.

В рамках гинекологического осмотра врач берет у пациентки мазок на цитологию – это скрининг рака шейки матки и предраковых состояний. Если результаты мазка показали наличие атипичных или злокачественных клеток, выполняется кольпоскопия (эндоскопический осмотр слизистой оболочки шейки матки) со взятием образца измененных участков для гистологического анализа.

Технологии определения рака шейки матки:

Аспирационная биопсия полости матки.
Гистероскопия – осмотр цервикального канала и полости матки с помощью оптического прибора (гистероскопа) с забором биоматериала.
Диагностическое выскабливание.

Диагностируется такими методами:

Мануальный осмотр – ректовагинальный или влагалищный.
УЗИ яичников.
КТ и МРТ.
Тест на онкомаркеры.
Лапароскопия со взятием образца ткани.

Этот вид болезни склонен к метастазированию, поэтому часто поиск ведется и в других органах.

Чаще всего болеют мужчины старше 50, и особенно, 60 лет. Поэтому мужчинам старшего возраста обязательно нужно проходить профилактические осмотры простаты. Это же касается лиц из группы риска, особенно, учитывая, что ранние стадии протекают бессимптомно.

Ректальный пальцевый осмотр.
Анализ крови на онкомаркер ПСА.

При подозрении на онкопроцесс обследование продолжают такими инструментами:

Трансректальным УЗИ. Выполняется через прямую кишку пациента. Позволяет исследовать предстательную железу, семенные пузырьки, уретру и окружающие ткани.
Мультифокальной игольчатой биопсией под ультразвуковым контролем. Это наиболее надежный способ диагностики рака предстательной железы.

Заподозрить злокачественную опухоль почек можно на основании клинических тестов.

Это появлении в моче крови и атипичных клеток в сочетании с повышением СОЭ и уровня эритроцитов крови. Биохимия крови покажет увеличение количества кальция и трансаминазы.

Для дальнейшей диагностики применяют:

УЗИ почек и брюшной полости.
Контрастная рентгенография почки.
КТ почек.
Ретроградная пиелография. Это рентгенография почечной лоханки, которая выполняется с введением цистоскопа в мочевую систему и контрастного красителя в мочеточники. Рентгеновские снимки используются для визуализации движения красителя и функционирования системы.
Прицельная биопсия под контролем УЗИ.
Селективная почечная ангиография. Определяет почечно-клеточный рак. При новообразованиях лоханок не применяется.

Тесты на онкомаркеры при раке почек не информативны.

Читайте также: