Проточная цитометрия в диагностике лейкозов

Ю.В. Миролюбова, Е.А. Стадник, Т.С. Никулина, В.В. Стругов, Т.О. Андреева, Ю.В. Вирц, Р.В. Грозов, А.Ю. Зарицкий

Для переписки: Юлия Владимировна Миролюбова, ул. Аккуратова, д. 2, Санкт-Петербург, Российская Федерация, 197341; e-mail: juli9702@yandex.ru

Для цитирования: Миролюбова Ю.В., Стадник Е.А., Никулина Т.С. и др. Роль поверхностного маркера CD200 в дифференциальной диагностике злокачественных В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний. Клиническая онкогематология. 2017;10(2):169–75.

РЕФЕРАТ

Актуальность и цели. Проточная цитофлюориметрия успешно используется в диагностике злокачественных лимфопролиферативных заболеваний. Однако иногда встречаются атипичные ситуации, сложные для интерпретации, что служит основанием для поиска новых маркеров, имеющих дифференциально-диагностическое значение. Цель — анализ экспрессии СD200 у больных со злокачественными В-клеточными лимфопролиферативными заболеваниями.

Материалы и методы. Обследовано 187 пациентов с хроническим лимфолейкозом (ХЛЛ), 14 — с лимфомой из клеток зоны мантии (ЛЗМ), 9 — с лимфомой из клеток маргинальной зоны (ЛМЗ), 5 — с волосатоклеточным лейкозом (ВКЛ). У 12 человек наличие опухоли не подтвердилось. Пациентам выполняли клинический анализ крови, иммунофенотипирование лимфоцитов периферической крови или костного мозга, цитогенетическое исследование. Части пациентов дополнительно проводилось иммуногистохимическое исследование материала, полученного при трепанобиопсии костного мозга или биопсии лимфатических узлов.

Результаты. У всех больные ХЛЛ и ВКЛ наблюдалась экспрессия CD200, средняя интенсивность флюоресценции была выше по сравнению с другими группами. В группе ЛЗМ преобладали пациенты с отсутствием экспрессии CD200. В то же время в 2 наблюдениях отмечалась промежуточная и отчетливая экспрессия CD200 c умеренной интенсивностью флюоресценции. В группе ЛМЗ экспрессия CD200 была гетерогенной.

Заключение. Отсутствие экспрессии CD200 исключает диагноз типичного ВКЛ и ХЛЛ. В таких ситуациях требуются цитогенетическое и иммуногистохимическое исследования опухолевых клеток для полной верификации диагноза, прежде всего ЛЗМ или ЛМЗ.

Ключевые слова: CD200, проточная цитометрия, диагностика, хронический лимфолейкоз, лимфома из клеток зоны мантии, лимфома из клеток маргинальной зоны, волосатоклеточный лейкоз.

Получено: 7 сентября 2016 г.

Принято в печать: 3 января 2017 г.

Читать статью в PDF

  1. Купрышина Н.А., Тупицын Н.Н. Проточная цитометрия в онкогематологии. Часть II. Основы и нововведения в диагностике хронического лимфолейкоза. Клиническая онкогематология. 2012;5(4):349–54. [Kupryshina NA, Tupitsyn NN. Flow cytometry in hematology malignancies. Part II: ABC and news in diagnostics of chronic lymphocytic leukaemia. Klinicheskaya onkogematologiya. 2012;5(4):349–54. (In Russ)]
  2. Стадник Е.А., Стругов В.В., Вирц Ю.В., Зарицкий А.Ю. Хронический лимфолейкоз. Рекомендации по диагностике и лечению. Трансляционная медицина. 2012;17:104–15. [Stadnik EA, Strugov VV, Virts YuV, Zaritskii AYu. Chronic lymphocytic leukemia. Guidelines for diagnosis and treatment. Translyatsionnaya meditsina. 2012;17:104–15. (In Russ)]
  3. Swerdlow SH, Campo E, Harris NL, et al, eds. WHO Classification of Tumours of Haematopoietic and Lymphoid Tissues. 4th edition. Lyon: IARC Press; 2008.
  4. Kohnke T, Wittmann VK, Sauter D, et al. Proposal For a Novel Scoring System For The Diagnosis оf CLL. Blood. 2013;122(21):47–5599 (Plenary Abstracts).
  5. Morice WG, Kurtin PJ, Hodnefield JM, et al. Predictive Value of Blood and Bone Marrow Flow Cytometry in B-Cell Lymphoma Classification: Comparative Analysis of Flow Cytometry and Tissue Biopsy in 252 Patients. Mayo Clin Proc. 2008;83(7):776–85. doi: 10.4065/83.7.776.
  6. Луговская С.А., Кисиличина Д.Г., Почтарь М.Е. и др. Новые маркеры (CD160, CD200, LAIR-1) в диагностике В-клеточных лимфопролиферативных заболеваний. Клиническая онкогематология. 2013;6(1):45–52. [Lugovskaya SA, Kisilichina DG, Pochtar’ ME, et al. New markers (CD160, CD200, and LAIR-1) in diagnosis of B-cell lymphoproliferative disorders. Klinicheskaya onkogematologiya. 2013;6(1):45–52. (In Russ)]
  7. Brunetti L, Di Noto R, Abate G, et al. CD200/OX2, a cell surface molecule with immuno-regulatory function is consistently expressed on hairy cell leukaemia neoplastic cells. Br J Haematol. 2009;145(5):665–78. doi: 10.1111/j.1365-2141.2009.07644.x.
  8. Palumbo GA, Parrinello N, Fargione G, et al. CD200 expression may help in differential diagnosis between mantle cell lymphoma and B-cell chronic lymphocytic leukemia. Leuk Res. 2009;33(9):1212–6. doi: 10.1016/j.leukres.2009.01.017.
  9. Dorfman DM, Shahsafaei A. CD200 (OX-2 Membrane Glycoprotein) Expression in B Cell–Derived Neoplasms. Am J Clin Pathol. 2010;134(5):726–33. doi: 10.1309/ajcp38xrrugsqovc.
  10. Sander B. Mantle cell lymphoma: recent insights into pathogenesis, clinical variability, and new diagnostic markers. Semin Diagn Pathol. 2011;28(3):245–55. doi: 10.1053/j.semdp.2011.02.010.
  11. Alapat D, Coviello-Malle J, Owens R, et al. Diagnostic Usefulness and Prognostic Impact of CD200 Expression in Lymphoid Malignancies and Plasma Cell Myeloma. Am J Clin Pathol. 2012;137(1):93–100. doi: 10.1309/ajcp59uorcyzevqo.
  12. El Desoukey NA, Afify RA, Amin DG, et al. CD200 expression in B-cell chronic lymphoproliferative disorders. J Investig Med. 2012;60(1):56–61. doi: 10.2310/jim.0b013e31823908f9.
  13. Pillai V, Pozdnyakova O, Charest K, et al. CD200 flow cytometric assessment and semiquantitative immunohistochemical staining distinguishes hairy cell leukemia from hairy cell leukemia-variant and other B-cell lymphoproliferative disorders. Am J Clin Pathol. 2013;140(4):536–43. doi: 10.1309/ajcpebk31vqqnddr.
  14. Challagundla P, Medeiros LJ, Kanagal-Shamanna R, et al. Differential Expression of CD200 in B-Cell Neoplasms by Flow Cytometry Can Assist in Diagnosis, Subclassification, and Bone Marrow Staging. Am J Clin Pathol. 2014;142(6):837–44. doi: 10.1309/ajcpbv9elxc0ecvl.
  15. Sandes AF, de Lourdes Chauffaille M, Regina C, et al. CD200 Has an Important Role in the Differential Diagnosis of Mature B-Cell Neoplasms by Multiparameter Flow. Cytometry. 2013;86(2):98–105. doi: 10.1002/cyto.b.21128.
  16. McCaughan GW, Clark MJ, Barclay AN. Characterization of the human homolog of the rat MRC OX-2 membrane glycoprotein. Immunogenetics. 1987;25(5):329–35. doi: 10.1007/bf00404426.
  17. Wright GJ, Jones M, Puklavec MJ, et al. The unusual distribution of the neuronal/lymphoid cell surface CD200 (OX2) glycoprotein is conserved in humans. Immunology. 2001;102(2):173–9. doi: 10.1046/j.1365-2567.2001.01163.x.
  18. Kretz-Rommel A, Qin F, Dakappagari N, et al. CD200 expression on tumor cells suppresses antitumor immunity: new approaches to cancer immunotherapy. J Immunol. 2007;178(9):5595–605. doi: 10.4049/jimmunol.178.9.5595.
  19. Moreaux J, Hose D, Reme T, et al. CD200 is a new prognostic factor in multiple myeloma. Blood. 2006;108(13):4194–7. doi: 10.1182/blood-2006-06-029355.
  20. Tonks A, Hills R, White P, et al. CD200 as a prognostic factor in acute myeloid leukemia. Leukemia. 2007;21(3):566–8. doi: 10.1038/sj.leu.2404559.
  21. Moreaux J, Veyrune JL, Reme T, et al. CD200: a putative therapeutic target in cancer. Biochem Biophys Res Commun. 2008;366(1):117–22. doi: 10.1016/j.bbrc.2007.11.103.
  22. Kretz-Rommel A, Bowdish KS. Rationale for anti-CD200 immunotherapy in B-CLL and other hematologic malignancies: new concepts in blocking immune suppression. Expert Opin Biol Ther. 2008;8(1):5–15. doi: 10.1517/14712598.8.1.5.

А.М. Попов 1 , Т.Ю. Вержбицкая 2,3 , Л.Г. Фечина 2 , А.В. Шестопалов 1,4 , С.А. Плясунова 1

Для переписки: Александр Михайлович Попов, канд. мед. наук, ул. Саморы Машела, д. 1, Москва, Российская Федерация, 117997; тел.: +7(495)287-65-70; e-mail: uralcytometry@gmail.com

Для цитирования: Попов А.М., Вержбицкая Т.Ю., Фечина Л.Г. и др. Острые лейкозы: различия иммунофенотипа бластных клеток и их неопухолевых аналогов в костном мозге. Клиническая онкогематология. 2016;9(3):302-13.

РЕФЕРАТ

Определение иммунофенотипа опухолевых бластных клеток в костном мозге методом проточной цитометрии на протяжении многих лет является одним из основных методов диагностики острых лейкозов (ОЛ). Клетки нормального лимфопоэза и миелопоэза, сходные по антигенному профилю с опухолевыми бластами, могут серьезно осложнять процесс диагностики ОЛ. Генетические нарушения, приводящие к образованию опухолевого клона, способствуют формированию иммунофенотипа, отличающегося от нормальных клеток. Аберрантная экспрессия маркеров, определяемая исключительно на бластных клетках ОЛ, формирует так называемый лейкоз-ассоциированный иммунофенотип. Определение лейкоз-ассоциированного иммунофенотипа методом многоцветной проточной цитометрии позволяет четко отличать нормальные и лейкозные клетки-предшественницы. Однако для этого необходим анализ большого количества маркеров одновременно на одних и тех же клетках, т. е. применение многоцветной проточной цитометрии с хорошо продуманными и отработанными панелями моноклональных антител. Кроме того, правильная оценка положения клеточных популяций на графиках требует максимально адекватной настройки цитометра, корректной подготовки проб и наличия у оператора достаточного опыта. Чаще всего соблюдение этих условий возможно в крупных лабораториях, проводящих референс-иммунофенотипирование в рамках многоцентровых исследований.

Ключевые слова: острые лейкозы, проточная цитометрия, экспрессия антигенов, иммунофенотип.

Получено: 19 февраля 2016 г.

Принято в печать: 16 марта 2016 г.

Заболеваемость злокачественными заболеваниями кроветворной и лимфоидной ткани (гемобластозами) с каждым годом увеличивается во всем мире.

По данным канцер-регистра Республики Беларуси, за 1999-2008 гг. стандартизованные показатели заболеваемости лейкозами и лимфомами составляли 20,1 на 100 000 населения. Неуклонно увеличиваются показатели смертности больных с лейкозами и злокачественными лимфомами.

Уровень 5-летней выживаемости больных с гемобластозами остается по-прежнему низким.

Под термином "лимфома" понимают большое количество различных видов заболевания, существенно отличающихся друг от друга по своим проявлениям и подходам к их лечению. Все лимфомы разделяют на 2 большие группы: лимфома Ходжкина (ЛХ) и неходжкинские лимфомы (НХЛ). Решение о принадлежности лимфомы к группе неходжкинских лимфом или к болезни Ходжкина принимается после гистологического исследования образца биопсированной ткани. Если при микроскопическом исследовании находят специфические для болезни Ходжкина клетки Березовского-Штернберга-Рида, то ставят диагноз болезни Ходжкина. Если эти специфические клетки не находят, то лимфому относят к группе неходжкинских. Неходжкинские лимфомы (НХЛ) — гетерогенная группа злокачественных лимфопролиферативных опухолей, различающихся по биологическим свойствам, морфологическому строению, клиническим проявлениям, ответу на терапию и по прогнозу. Вероятность развития неходжкинских лимфом значительно повышается с возрастом — почти в 20 раз после 80 лет. По темпу прироста заболеваемость НХЛ опережает ЛХ. Средний возраст пациентов с НХЛ 50-60 лет.

За 170 лет изучения злокачественных НХЛ, в отличие от ЛХ, претерпели множество терминологических изменений: лимфосаркома, злокачественная лимфома, лимфобластома, ретикулосаркома, гематосаркома и др., что свидетельствует о клинико-морфологической сложности данной группы заболеваний.

Этиология неходжкинских лимфом недостаточно ясна. Установлена роль вируса Эпштейна–Барр в возникновении одной из редких форм — лимфомы Беркитта. Риск развития НХЛ значительно повышается при ВИЧ-инфекции, первичных и вторичных иммунодефицитах. В настоящее время установлено, что НХЛ — злокачественная опухоль из клеток иммунной системы клонального характера. Изучается роль человеческого Т-клеточного лимфотропного вируса I-го типа и вируса герпеса. Наследственные факторы в возникновении НХЛ не имеют существенного значения. Отмечено увеличение заболеваемости НХЛ при длительном контакте с пестицидами. Лимфома Ходжкина - название введено Всемирной Организацией Здравоохранения (ВОЗ) в 2001г., - это опухолевое заболевание лимфатической системы. Впервые описано Томасом Ходжкиным в 1832 г. Хотя риск развития лимфомы Ходжкина достаточно низок – 0,24% среди мужчин и 0,2% среди женщин, около 15% всех случаев приходится на молодой возраст – от 15 до 24 лет. Лимфома Ходжкина имеет уникальную бимодальную (иногда трёхмодальную) возрастную кривую - заболеваемость имеет два пика - первый приходится на возраст 15-40 лет, а второй постепенно нарастает после 50 лет.

Хронические лимфопролиферативные заболевания (ХЛПЗ) объединяют целую группу биологически различных опухолей, возникающих в результате накопления и/или пролиферации клональных морфологически зрелых лимфоцитов. Сама природа этих клеток делит заболевания на две большие группы: Т-клеточные и В-клеточные хронические лимфопролиферативные заболевания, внутри которых на основании клинических проявлений и опухолевого происхождения выделяют:

  • собственно лейкозы, всегда протекающие с вовлечением периферической крови;
  • лейкемическая стадия (лейкемизация) лимфомы, при которой источником заболевания является периферическая лимфоидная ткань, но клинические проявления, ответ на ХТ и прогноз соответствуют лейкозу;
  • лимфоматозные формы, при которых кровь крайне редко вовлекается в патологический процесс.

Иммунофенотипическая диагностика ХЛПЗ по фенотипическому профилю клеток периферической крови возможна только в двух ситуациях:

  • при выходе в системный кровоток опухолевых (трансформированных) лимфоцитов зрелоклеточной морфологии (пролимфоцитарный, лимфоцитарный, волосатоклеточный лейкозы);
  • при лейкемизации лимфомы, когда происходит экспансия опухолевых клеток в периферическую кровь и костный мозг (фолликулярная лимфома, лимфома клеток маргинальной зоны, лимфомы скоплений лимфоидной ткани, ассоциированной со слизистыми, лимфома селезенки с отросчатыми (ворсинчатыми) лимфоцитами, лимфома кожи.

Проведение диагностического ИФТ оправдано при выявлении в периферической крови абсолютного и относительного лимфоцитоза. Пороговый уровень лимфоцитоза, при котором считается необходимым проводить диагностическое ИФТ за последние годы снизился с 10х10 9 /л [74] до 5х10 9 /л.

С начала 80-х годов ХХ века, когда развитие гибридомной технологии позволило получать моноклональные антитела любой специфичности, стало возможным нарастающее по сложности и объему информации иммунофенотипирование.

Проточная цитометрия (ПЦ) является интегральным инструментом изучения различных биологических систем с помощью регистрации флюоресценции и использования флюоресцентных красителей, способных связываться с различными компонентами клетки.

В основе метода проточной цитометрии лежит измерение оптических свойств клеток. Клетки по одиночке вводятся в ламинарный поток в проточной кварцевой кювете, где они пересекают сфокусированный световой пучок, не касаясь стенок кюветы. Источником света могут быть различные лазеры, ультрафиолетовая лампа или их комбинация. Свет определенной длины волны возбуждает молекулы флуоресцирующих красителей, связанных с различными клеточными компонентами, при этом может происходить одновременное возбуждение нескольких разных красителей, что позволяет оценивать сразу несколько клеточных параметров. Свет, испускаемый красителями, собирают с помощью системы линз и зеркал и раскладывают на компоненты. Световые сигналы улавливаются и преобразуются в электрические импульсы фотоумножительным устройством. Далее информация обрабатывается в цифровом режиме. Величины, измеренные фотоумножителем, отображаются на гистограммах. Современные проточные цитофлуориметры позволяют одновременно измерять несколько (до восьми) параметров: рассеяние света на малые углы (до 10°), которое еще называют прямым светорассеянием (forward scattering или FSC); рассеяние света на угол 90°, т.н. боковое светорассеяние (side scattering или SSC]; интенсивность флуоресценции на разных длинах волн. Параметры светорассеяния позволяют проводить разделение клеток по размерам, форме, состоянию клеточной мембраны и характеристикам цитоплазмы.

Традиционно концентрация клеток определяется путем разделения пробы на две части и сравнение результатов анализа иммунофенотипирования, выполненного на проточном цитометре с результатами подсчета клеток на гематологическом анализаторе. Такая процедура приводит к дополнительным затратам времени, средств и мощностей лабораторного оборудования. В настоящее время на рынке имеются наборы калибровочных частиц для определения концентрации клеток непосредственно на проточном цитометре, однако их использование также связано с дополнительными затратами. Проточные цитометры являются полностью открытыми системами, что не ограничивает пользователя в выборе реагентов.

При анализе клеток, маркированных двумя, тремя или четырьмя антителами, коньюктированными с различными цветовыми метками, необходимо проводить компенсацию сигналов с флуоресцентных каналов проточного цитометра из-за перекрытия спектров эмиссии используемых красителей.

Проточная цитометрия позволяет определить долю клеток, находящихся в S-фазе и оценить степень пролиферации. С помощью ДНК-гистограмм возможно четко разделить клетки, находящиеся в G1-, S- и G2/M-фазах клеточною чикла. Совокупность информации о содержании ДНК, маркеров апоптоза и клеточной пролиферации, имеет важное значение в дифференциальной диагностике онкологических заболеваний крови и солидных опухолей.

Диагностика лейкозов, лимфом в настоящее время одна из наиболее передовых областей использования проточной цитометрии. Иммунофенотипирование клеток крови и костного мозга обеспечивает ключевой информацией для качественной диагностики и оценки прогноза заболевания.

Трансплантация костного мозга (ТКМ) при лимфомах и лейкозах предполагает перенос стволовых мультипотентных клеток, ответственных за восстановление нормального гемо- и лимфопоэза, в противоположность гемотрансфузиям, которые дают временный эффект. Кроветворные клетки для ТКМ могут быть получены из костного мозга, периферической и пуповинной крови. Процедура ТКМ более не является экспериментальным методом, а составляет важный компонент в лечении онкологических и наследственных заболеваний. Рецептор CD34 используется как маркер полипотентных кроветворных стволовых клеток. Подсчет абсолютного числа CD34+ клеток при помощи проточной цитометрии является золотым стандартом в оценке количества кроветворных клеток.

Таким образом, проточная цитометрия имеет достаточно широкие возможности для решения различных диагностических и исследовательских задач, делая лабораторное исследование технологичным, точным и своевременным.

Широкие возможности ее применения связаны с тем, что интенсивность флюоресценции прямо пропорциональна количеству контролируемого вещества в клетке, однако при определенных условиях могут быть зарегистрированы очень малые количества флюорохрома, в том числе меньше 1000 молекул на клетку. Некоторые флюоресцентные красители могут менять параметры флюоресценции внутри живых клеток и превращаться из нефлюоресцирующих во флюоресцирующие под воздействием определенных ферментов, изменять спектр флюоресценции под действием ионов кальция, их можно применять при конструировании молекулярных зондов.

Возможности ИФТ в прогнозировании течения и исхода онкогематологических заболеваний во многом определяются адекватным набором антител для первичной диагностики.

Развитие технологий в области мультипараметрического анализа, гейтирования по CD45, автоматизированного анализа кластеров и стандартизации аппаратуры достаточно быстро перевело проточные цитометры из разряда приборов научного использования в рутинное оборудование клиник и сделало саму ПЦ стандартом лабораторной диагностики в области иммунофенотипирования клеток. Выявление молекул, тем или иным образом интегрированных с клеточной мембраной, является только одной из сфер применения ПЦ, но именно она имеет максимальное диагностическое значение.

Все большее количество определяемых параметров позволяет изучать все более сложные фенотипы нормальных и злокачественных лейкоцитов, и, следовательно, все более тонкие аберрации, выделяющие опухолевую клетку в присутствии нормальных клеточных компонентов крови и костного мозга. Эти возможности и превратили проточную цитометрию в метод выбора при определении линейной принадлежности и уровня созревания злокачественных клеток при острых лейкозах и лимфомах.

Виды биологического материала, направляемого на тестирование для выявления лейкоза/лимфомы и определения их природы, достаточно разнообразны: периферическая кровь, аспират костного мозга, трепанобиоптат, взвесь клеток лимфатического узла, ликвор, плевральная жидкость.

Мультипараметрический анализ позволяет уменьшить необходимый объем образца, время пробоподготовки и фактического анализа, сокращая тем самым путь от получения биологического материала до клинического результата – иммунофенотипического диагноза. Проточная цитометрия предоставляет три типа данных:

  • необработанные данные интенсивности флюоресценций в формате, определяемым программным обеспечением прибора;
  • относительное содержание (%) различных клеточных популяций по оценке врача, проводящего анализ биологического материала;
  • информация по единичным маркерам, имеющим принципиальное значение для клиники (например, CD34 + при исследованиях в области гемопоэтических стволовых клеток (ГСК)).

Последующая экспертная оценка всей совокупности данных, ведущая к установлению диагноза является дополнительным источником вариабельности окончательных результатов за счет выбора метода оценки антигенной экспрессии и критериев интерпретации первичных данных.

Мультипараметрические возможности оценки клеток стали использовать для выявления фенотипических аберраций лейкозных клеток с максимальной вероятностью специфических генетических поломок для подтверждения которых необходима молекулярная диагностика. Известно, что среди пациентов с идентичным, в том числе нормальным, кариотипом или генетическими аберрациями прогрессия заболевания различна и не всегда предсказуема, что требует поиска дополнительных критериев информации, которыми могут оказаться данные ИФТ. При невозможности получить метафазные пластинки выявление хромосомных аберраций может быть осуществлено с помощью молекулярных проб и определения профиля экспрессии генов в злокачественных клетках. Немногочисленные работы применения микроэррей-технологии при острых лимфобластных лейкозах показали перспективность этого направления при поиске новых прогностических признаков генетических нарушений и прогноза заболевания. К сожалению, молекулярно-биологические исследования не являются рутинными для многих, в том числе специализированных, клиник, а там, где осуществляются, получение информации значительно дистанцировано во времени от получения биологического материала. С клинической точки зрения, это, скорее, подтверждающие (или отрицающие) диагноз исследования, но не определяющие его.

Для проведения иммунофенотипической диагностики лейкозов и лимфом необходимо выделить клетки, являющиеся субстратом заболевания. До появления методических возможностей работы с цельной кровью (костным мозгом) при диагностике гемобластозов только использование градиентного центрифугирования создавало возможность анализа трансформированных клеток, патологических лимфоцитов и бластов. За такое увеличение относительного содержания опухолевых клеток приходилось платить потерей возможности оценить клеточный состав образца в целом. Поэтому, если еще в середине 90-х годов ХХ века выделение мононуклеаров на градиенте плотности расценивалось как обязательный этап пробоподготовки, то позднее пришли к однозначному предпочтению лизиса при работе с образцами онкогематологических пациентов.

Для определения возможности проведения ИФТ необходима информация о количестве лейкозных бластов в образце, так как при их низком содержании (менее 20%) фенотипический профиль бластной популяции может быть оценен неправильно. Принято считать, что относительное содержание бластов указано в миелограмме, сопровождающей костный мозг, направляемый на ИФТ. Однако на практике нередко материал стернальной пункции одновременно направляется морфологу для получения детальной миелограммы и иммунологу для определения варианта лейкоза, т.е. клеточность образца неизвестна. Кроме того, возможное разведение костного мозга периферической кровью может серьезно влиять на конечный результат исследования. Следствием этого оказывается необходимость вносить специфические антитела в избытке, а не из расчета на количество клеток. Для определения уровня бластоза при ПЦ необходимо средствами программного обеспечения отделить собственно клетки от дебриса и сдвоенных клеток, которые могут в разном количестве присутствовать в анализируемом образце и особенно часто выявляются при хронических лимфопролиферативных заболеваниях.

Основной задачей ИФТ является получение информации, которая позволяет установить факт наличия гемобластоза и его иммунологический вариант, а последующая их интерпретация предполагает интегральный анализ ИФТ и других клинических и лабораторных данных.

Литература


Автореферат диссертации по медицине на тему Проточная ДНК-цитометрия костного мозга у больных острыми лейкозами

КУЧМА ЮРИЙ МИРОСЛАВОВИЧ

ПРОТОЧНАЯ ДНК-ЦИТОМЕТРИЯ КОСТНОГО МОЗГА У БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ

14.00.29 - Гематология и переливание крови

АВТОРЕФЕРАТ диссертации на соискание ученой степени кандидата медицинских наук

Работа выполнена в Главном военном клиническом госпитале имени академика Н.Н.Бурденко и Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук.

доктор медицинских наук, профессор В. Г. Савченко, доктор медицинских наук Д. А. Шмаров

доктор медицинских наук, профессор М.А.Волкова доктор медицинских наук Е.В.Домрачева

Ведущее научное учреждение:

Научно-исследовательский институт детской гематологии

Защита состоится "_"_2002 г. в_час.

на заседании диссертационного совета Д 001.042.01 в Государственном учреждении Гематологический научный центр Российской академии медицинских наук.

(Москва, 125167, Новозыковский пр., 4А)

С диссертацией можно ознакомиться в библиотеке Гематологического научного центра РАМН.

Автореферат разослан " /У"

Учёный секретарь диссертационного совета кандидат биологических наук

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА РАБОТЫ

Актуальность проблемы. Современные программы противоопухолевой химиотерапии (ХТ) базируются в основном на эмпирическом анализе результатов лечения в многоцентровых исследованиях. Несмотря на постоянное совершенствование протоколов ХТ острых лейкозов на основе эмпирического подхода, в значительном числе случаев ремиссии достигнуть не удается, особенно при рецидивах заболеваний. Изыскание новых подходов к применению цитостатических средств, увеличение избирательности и эффективности их действия связано с углубленным изучением процессов клеточной кинетики при лейкозах. Различия в чувствительности клеток к действию цитостатиков обусловлены особенностями их пролиферации. Вместе с тем, такое классическое понятие онкологии, как величина ростовой фракции опухоли до настоящего времени не получило должного распространения в лейкозологии. По-видимому, это связано с трудностями применения методов исследования клеточного цикла в клинической практике. В период ремиссии заболевания в организме остается около 100 миллионов лейкозных клеток. Однако реальная возможность контроля опухолевого клона весьма ограничена. Для мониторинга минимальной остаточной болезни необходимы дополнительные методы исследования. С появлением метода проточной ДНК-цитометрии представилась возможность быстрого и информативного анализа распределения клеток по содержанию ядерной ДНК с высокой разрешающей способностью. Это позволяет определять параметры клеточного цикла и , выявлять анеуплоидные клеточные клоны. Исходя из этого, внедрение проточной ДНК-цитометрии костного мозга в клиническую практику представляется актуальной задачей.

Цель работы: оценка пролиферации и плоидности клеток костного мозга у больных острыми лейкозами до и после ХТ методом проточной ДНК-цитометрии, использование полученных данных в гематологической практике. Основные задачи исследования

1. Методом проточной ДНК-цитометрии у больных с острыми миелоидными лейкозами исследовать распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла до и после ХТ и установить его влияние на показатели миелограммы и крови.

2. Изучить влияние стандартной ХТ на пролиферацию миелокариоцитов больных острыми миелоидными лейкозами.

3. Установить различия в пролиферации клеток костного мозга больных, достигших и не достигших ремиссии заболевания.

4. Исследовать ДНК-плоидность клеток костного мозга при острых лейкозах в динамике заболевания и возможность использования её для контроля минимальной остаточной болезни.

Научная новизна. Показано, что метод проточной ДНК-цитометрии позволяет достоверно оценивать пролиферативную активность миелокариоцитов и выявлять анеуплоидные клеточные клоны у больных острыми лейкозами. Установлено, что фракция покоя костного мозга прямо коррелирует с величиной опухолевой массы, а пролиферирующая фракция зависит от сохранности нормальных ростков кроветворения. Острые миелоидные лейкозы (ОМЛ) в активной фазе характеризуются снижением фракции роста костного мозга по сравнению с нормой. При выходе заболевания в ремиссию после курса ХТ наблюдается значительное повышение пролиферативной активности кроветворных клеток, связанное с регенерацией нормального кроветворения. ДНК-анеуплоидия выявляется у 21% пациентов с острыми лейкозами и может быть использована для мониторинга минимальной остаточной болезни в фазе ремиссии заболевания.

Теоретическое и практическое значение работы. Полученные данные расширяют современные представления о пролиферации клеток костного мозга при острых лейкозах. Метод проточной ДНК-цитометрии можно применять для оценки гемопоэза до и в процессе ХТ острых лейкозов, разработки новых программ ХТ.

Апробация диссертации. Материалы работы докладывались и обсуждались на: научно-практической конференции ГВКГ им. Н.Н.Бурденко "Возможности и перспективы диагностики и лечения в клинической практике" (Москва, 1992); международном симпозиуме "Новые направления в развитии гематологии" (Санкт-Петербург, 1992, 1994); V Российском съезде специалистов по лабораторной диагностике (Москва, 1995); гематологической секции Московского научного общества терапевтов (Москва, 1996); научно-практической конференции "Клиническая лабораторная диагностика -состояние и перспективы" (Санкт-Петербург, 1996); конференции "Анализ изображения клеток системы крови: настоящее и будущее" (Москва, 1996); симпозиуме "Национальные дни лабораторной медицины России" (Москва, 1997).

Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов, списка литературы, включающего 54 отечественных и 147 зарубежных источников. Изложена на 118 страницах, содержит 7 таблиц и 43 рисунка.

Положения, выносимые на защиту.

1. Проточная ДНК-цитометрия костного мозга даёт возможность исследовать распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла и использовать эти данные в повседневной клинической практике.

2. С увеличением опухолевой массы при ОМЛ происходит снижение доли миелокариоцитов, вступающих в клеточный цикл.

3. Восстановление нормального кроветворения после курса ХТ сопровождается выраженным увеличением пролиферативной активности миелокариоцитов, что является признаком выхода острого лейкоза в ремиссию.

4. У больных острыми лейкозами проточная Д НК-цитометрия костного мозга

позволяет выявлять анеуплоидные клоны клеток и в отдельных случаях

контролировать минимальную остаточную болезнь.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В основу настоящей работы были включены результаты 304 исследований клеточного цикла миелокариоцитов у 122 больных острыми лейкозами. 172 исследования проведено у 62 больных ОМЛ и 132 исследования у 60 больных острым лимфобластным лейкозом (OJIJI). В группу больных OMJI вошли 51 мужчина и 11 женщин в возрасте от 18 до 82 лет на момент развития заболевания, средний возраст - 33 года. Для индукции и консолидации ремиссии у больных OMJI использовались цитозин-арабинозид, даунорубицин и 6-меркапгопурин по программам ХТ "7+3" и "TAD-9". Поддерживающая ХТ проводилась ежемесячными ротирующими 5-дневными курсами, в которых цитозин-арабинозид последовательно комбинировался с рубомицином, 6-меркаптопурином, винкристином и циклофосфаном в течение 3 лет. Среди больных OJIJI было 52 мужчин и 8 женщин в возрасте от 17 до 63 лет, средний возраст - 29 лет. Больные ОЛЛ получали ХТ по протоколу немецкой группы исследования острых лейкозов 04/89. Протокол предусматривал 8-недельную индукцию ремиссии, включавшую винкристин, рубомицин, L-аспарагиназу, преднизолон, циклофосфан, 6-меркаптопурин, цитозар. Далее проводились две 5-дневные консолидации цитозаром и вепезидом, 6-недельная реиндукция и поддерживающая ХТ 6-меркаптопурином и метотрексатом в течение 3 лет.

Анализ показателей прслиферативной активности костного мозга проводился только в группе ОМЛ. Это связано с тем, что основная масса исследований была выполнена у больных в процессе проведения ХТ, и с самого начала существовал вопрос, как отделить изменения пролиферации, обусловленные заболеванием, от изменений, обусловленных цитостатическим воздействием. Часть больных получили цитостатики или преднизолон до поступления в госпиталь. Поэтому после сбора анамнеза и анализа всей медицинской документации в группу больных, достоверно не получивших лекарственных препаратов до первичного исследования пролиферации, вошло только 20 человек. Длительность заболевания от первых клинических проявлений до первой ДНК-цитометрии костного мозга составляла от 6 до 66 дней. На основании данных, полученных от этих больных, были сделаны выводы о влиянии заболевания на пролиферацию клеток костного мозга.

152 исследования у 53 больных ОМЛ было проведено в различные сроки после окончания курсов ХТ. Поскольку лечение больных с ОМЛ проводилось прерывистыми курсами, период восстановления кроветворения, прошедший от окончания цитостатического воздействия до момента исследования, имел

решающее влияние на показатели пролиферации. Поэтому все исследования, проведенные после ХТ, были сгруппированы по недельным интервалам от + 1 до + 50 дня (от 0 до 7 недель соответственно) таким образом, чтобы отклонения по срокам не превышали 3 дней. Была определена динамика изменений пролиферации костного мозга в зависимости от срока, прошедшего с момента окончания курса ХТ. Основная часть исследований после курсов ХТ выполнена через 3-4 недели после их завершения, перед началом очередного курса. Однако по различным причинам, как правило, связанным с осложнениями химиотерапии, перерывы между очередными курсами лечения были значительно увеличены и пункции костного мозга выполнялись через 5, 6 и 7 недель после завершения курса. Часть исследований были выполнены непосредственно в момент окончания ХТ, а также через 1 и 2 недели после окончания курса. Таким образом, были получены данные о зависимости пролиферативной активности миелокариоцитов от времени, прошедшего с момента цитостатического воздействия. Корреляционный анализ между показателями ДНК-гистограммы и миелограммы проводился в точках, стандартизированных по недельным интервалам после воздействия стандартных по интенсивности курсов ХТ. Период наблюдения за больными с проведением ДНК-цитометрии костного мозга составлял от 1 до 43 месяцев. Учитывалось также общее число проведенных курсов ХТ, которое составляло у разных больных от 1 до 29. Исследование пролиферативной активности костного мозга в динамике при ОЛЛ требовало принципиально иного подхода в связи с другим характером химиотерапии и в данном исследовании не проводилось. Изучение частоты ДНК-анеуплоидии проведено в группах ОМЛ и ОЛЛ. Клеточный состав костного мозга (миелограмму) и периферической крови анализировали в препаратах, окрашенных по Романовскому.

Распределение миелокариоцитов по фазам клеточного цикла (0ол, Б, С2М) производили методом проточной ДНК-цитометрии. Для окраски клеточной ДНК использовали одновременно два красителя - бромистый этидий и хромомицин А3. Клетки костного мозга получали пункцией грудины или подвздошной кости. После того как игла со шприцем вынута из кости и содержимое помещено на предметное стекло, в опорожненный шприц набирали 0,5 мл раствора, содержащего цитрат натрия в концентрации 1 г/л и флуоресцентный краситель бромистый этидий (0,05 г/л). Получившийся смыв клеток со стенок иглы и шприца помещали в пробирку. Раствор цитрата натрия вызывал лизис эритроцитов и способствовал хорошему связыванию флуоресцентных зондов с ядерной ДНК. Концентрация клеток получалась оптимальной для последующих проточно-цитометрических измерений. К полученной взвеси добавляли равный объём раствора хромомицина А3. При совместном использовании двух флуоресцентных зондов значительно возрастает интенсивность реакции и повышается точность измерений. Непосредственно перед измерением полученную взвесь инкубировали с рибонуклеазой.

Работа выполнена на проточном цитофлуориметре - анализаторе и сортировщике клеток EPICS-C (Coulter Electronics, США). Для возбуждения флуоресценции применяли длину волны 457,9 нм от аргонового лазера "Argon-Innova 90-6" ("Coherent", США) с выходной мощностью 6 Вт. Эмиссионным объективом световые сигналы углового светорассеяния и флуоресценции фокусировались на соответствующих детекторах, которые преобразовывали их в электрические импульсы и регистрировались компьютером прибора. В процессе прохождения образца прибор обеспечивал одновременное измерение до 6 параметров клетки с представлением результатов в виде четырех одно- и двухпараметровых гистограмм. Установка оборудована компьютером для обработки данных, сопряженным с процессором самого прибора. В одном образце анализировали, как правило, 30 тысяч клеток. Комплексное тестирование аппаратуры проводили при помощи стандартных калибровочных частиц, которые применяли как для оценки точности работы приборов, так и для их ежедневной настройки. Для анализа ДНК-гистограмм использовалась специальная компьютерная программа распределения клеток по содержанию ДНК. В отношении клеток костного мозга больных острыми лейкозами метод флуоресцентной окраски и проточной ДНК-цитометрии обладал достаточно высокой точностью и воспроизводимостью результатов. При измерении отдельных образцов отношение пиков G,M/G0/| составляло 1,95-2,04, что свидетельствовало о хорошей линейности измерений. Основным параметром, характеризующим разрешающую способность метода, является коэффициент вариации, который рассчитывали по ширине пика Gn/1. Этот показатель в большинстве случаев не превышал 3,5%. Значения коэффициентов вариации использовали в качестве критерия для определения принадлежности популяции определенному клеточному клону. Обнаружение ДНК-анеуплоидного клона подтверждалось его регистрацией в двух разных образцах костного мозга при условии совпадения индексов ДНК. Статистическая обработка результатов исследований выполнена с помощью пакета компьютерных программ Statistica и Stat View. Диаграммы получены при помощи программ Statistica и Microsoft Excel.

Фрагменты работы выполнены в соавторстве с к.б.н. О.Н.Поповой, Е.А.Белоусовым, Н.М.Щербаковым, к..ф.-м..н. С.М.Куликовым.

РЕЗУЛЬТАТЫ СОБСТВЕННЫХ ИССЛЕДОВАНИЙ

ПАРАМЕТРЫ КЛЕТОЧНОГО ЦИКЛА КОСТНОГО МОЗГА БОЛЬНЫХ ОСТРЫМИ ЛЕЙКОЗАМИ ДО НАЧАЛА ХИМИОТЕРАПИИ.

Использование метода проточной ДНК-цитометрии для исследования клеточного цикла миелокариоцитов позволило получать данные о пролиферации костного мозга одновременно с миелограммой. При сопоставлении ДНК-гистограмм и миелограмм больных острыми лейкозами было обращено внимание, что ростовая фракция костного мозга больных до начала ХТ меньше, чем в норме. Это не соответствовало общим представлениям о повышенной скорости пролиферации опухолевых клеток при остром лейкозе. Тотальная бластная трансформация костного мозга сопровождалась низкими параметрами пролиферации, а после курса ХТ она значительно повышалась, изменяясь во времени. Мы поставили перед собой задачу установить, какие показатели ДНК-гистограммы костного мозга больных до начала ХТ являются наиболее информативными и коррелируют с показателями миелограммы, периферической крови и клиническими данными. Для корреляционного анализа выбрали 8 показателей ДНК-гистограммы, 10 показателей миелограммы, 8 показателей клинического анализа крови, а также возраст больного, вариант лейкоза и длительность заболевания от первых клинических проявлений до момента первого исследования пролиферации костного мозга. Анализируемые показатели представлены в таблицах I, II, III.

Показатели ДНК-гистограммы костного мозга

1 % G0G1 - % клеток в фазах GO и G1 (фракция покоя)

2 % G2M - % клеток в фазах G2 и М

3 % S - % клеток в фазе S

4 % S+G2M — сумма % клеток в фазах S, G2 и М (фракция роста)

5 G0G1/S —соотношение фракций G0G1 и S

6 G0G1/G2M - соотношение фракций G0G1 и G2M

7 S/G2M - соотношение фракций S и G2M

8 G0G1/S+G2M- соотношение фракций G0G1 и S+G2M

Читайте также: