Ядерная экспрессия в опухоли что это

Д.Г. Пасечник 1 , М.И. Коган 1 , З.М. Ахохов 2

В настоящее время почечно-клеточный рак (ПКР) является значимой проблемой урологии. Он составляет 3 % злокачественных новообразований у взрослого населения. Заболеваемость ПКР растет за последние десятилетия в среднем на 3–4 % в год. Возможно, этот рост связан с широким распространением методов прижизненной визуализации почек (УЗИ, компьютерная томография, магнитно-резонансная томография) [1]. Существующие способы оценки прогноза, учитывающие клинические особенности новообразования, его стадию, степень дифференцировки, гистологические особенности, несмотря на высокую прогностическую способность, не могут с достаточной точностью предсказать течение опухолевого процесса у конкретного пациента, так как не учитывают индивидуальные свойства ПКР. Кроме того, затруднена оценка прогноза при разных стадиях новообразования. В связи с этим современный подход к прогнозированию клинического течения ПКР заключается в поиске биологических маркеров, определяющих ключевые свойства опухоли, такие как повышенная пролиферативная активность, резистентность к апоптозу, способность к инвазии и метастазированию, подавление иммунных реакций [2].

Целью нашей работы было оценить особенности экспрессии молекул, связанных с фенотипом раковой стволовой клетки (CD133, N-кадгерин): TGF-α — фактора роста для эпителия канальцев и карбоангидразы IX (CAIX) — одной из ключевых молекул, связанных с VHL-молекулярным путем канцерогенеза при ПКР.

Материалом для исследования послужило 61 наблюдение ПКР (35 случаев светлоклеточного варианта ПКР, 13 — папиллярного варианта первого типа, 13 — хромофобного варианта ПКР). Для проведения морфологического исследования использовали операционный материал после радикальной нефрэктомии. Фрагменты опухоли фиксировали в 10 % забуференном нейтральном формалине, проводили и заливали в парафин по классической методике. Гистологические срезы окрашивали гематоксилином и эозином. Для иммуногистохимического исследования использовали панель антител, включающую антитела к TGF-a (TGF-α, dilution 1 : 100, Аbcam, Cambridge, United Kingdom), N-кадгерину (N-Cadherin, клон M3613; dilution 1 : 50, Dako, Glostrup, Denmark), CD133 (Prominin-1 dilution 1 : 200, Biorbyt, Cambridge, United Kingdom), карбоангидразе IX (CAIX; NCL–L-CAIX, dilution 1 : 100, Leica Biosystems, Hamburg, Germany). Выраженность экспрессии маркеров оценивали полуколичественным методом: 0 баллов — отсутствие экспрессии — при отсутствии клеток опухоли в препарате; 1 балл — слабая экспрессия — до 10 % клеток опухоли в препарате; 2 балла — умеренная экспрессия — от 11 до 30 % клеток опухоли в препарате; 3 балла — сильная экспрессия — свыше 30 % опухоли в препарате. Кроме того, учитывали топику позитивной реакции — мембранная, цитоплазматическая или ядерная. Статистическую обработку полученных параметров проводили с применением пакета прикладных программ Statistica 6.1. Для выявления различий между сравниваемыми группами использовали непараметрический критерий Манна – Уитни, для сравнения бинарных данных — точный критерий Фишера и Хиквадрат.

Результаты исследования

1. TGF-α TGF-α — мультифункциональный клеточный регуляторный пептид с широким спектром эффектов, связанных с клеточным ростом и дифференцировкой. В почке он является стимулятором пролиферации эпителия проксимальных канальцев. Эффекты TGF-α реализуются через рецепторы к эпидермальному фактору роста [3, 4].

2. N-кадгерин N-кадгерин — это мембранный белок из надсемейства кадгеринов, участвующий в образовании кальцийзависимых межклеточных контактов. Высокий уровень экспрессии этого кадгерина характерен для мезодермы эмбриона. Исследования последних лет указывают на то, что N-кадгерин может быть маркером эпителиально-мезенхимального перехода, определяющим приобретение опухолевыми клетками агрессивных свойств (инвазия и метастазирование) [5].

3. CD133 СD133, или проминин-1, — трансмембранный гликопротеин, который экспрессируется в гемопоэтических стволовых клетках [6]. Последние годы экспрессию этого белка используют для выделения пула так называемых раковых стволовых клеток. Гипоксия и активация HIF-1α могут индуцировать пролиферацию CD133+-клеток. Экспрессия CD133+ может быть динамичной и меняться в зависимости от состояния микроокружения клеток [7].

Экспрессия CD133 встретилась в 37 наблюдениях рака почки (60,6 %). Наиболее часто CD133 выявляли при светлоклеточном (80 %) (рис. 8, 9) и папиллярном (рис. 10) вариантах ПКР (69,2 %). При хромофобном раке экспрессия CD133 отсутствовала. Для CD133 характерна преимущественно цитоплазматическая экспрессия (60,6 %), реже — мембранная (44,3 %).

4. Карбоангидраза IX Карбоангидраза IX (CA-IX) является HIF-1αрегулируемым трансмембранным белком, связанным с новообразованиями, агрессивным фенотипом опухоли и неблагоприятным прогнозом при светлоклеточном раке почки [8]. Принято считать, что CA-IX помогает в регулировании внутриклеточного и внеклеточного уровней рН в ответ на гипоксию ткани опухоли.

Обсуждение

Наше исследование продемонстрировало, что экспрессия TGF-α, N-кадгерина, CD133 и CA-IX отличается при разных гистогенетических формах ПКР, что отражает особенности молекулярно-биологических путей, лежащих в основе их развития. Так, экспрессия CA-IX присуща только светлоклеточному варианту ПКР, экспрессия N-кадгерина, CD133 характерна для светлоклеточных опухолей и папиллярного варианта ПКР первого типа и отсутствует при хромофобных раках. Наши результаты согласуются с данными литературы. Так, В. Knebelmann et al. (2009) указали, что экспрессию TGF-α может подавлять белок VHL. Ряд исследователей продемонстрировали повышенную экспрессию TGF-α по сравнению с нормальной тканью при светлоклеточном и папиллярном вариантах почечно-клеточного рака [9, 10]. При этом показано, что этот фактор роста — один из вероятных факторов, индуцирующих развитие рака почки уже на ранних стадиях. При хромофобном варианте рака почки отсутствует экспрессия TGF-α, что, возможно, определяет низкий злокачественный потенциал этой формы новообразований и их слабую васкуляризацию [11]. Экспрессия N-кадгерина при светлоклеточном и папиллярном вариантах почечно-клеточного рака описана в работах J. Markovic-Lipkovski et al. (2001), T. Shimazui et al. (2006), C.L. Behnes et al. (2012) [12–14]. Гистогенетическая связь экспрессии этих маркеров с разными вариантами ПКР может позволить использовать их для морфологической дифференциальной диагностики. Кроме того, выявление этих молекул в биологических жидкостях (кровь, моча) может дать возможность проводить скрининг и мониторинг рака почки у пациентов.

Участие исследованных нами молекул в основных молекулярных путях развития и прогрессии ПКР определяет их прогностическое значение. Так, показана роль N-кадгерина в трансэндотелиальной миграции раковых клеток, что является важным этапом в процессе метастазирования [5]. Повышенная экспрессия этого маркера может ассоциироваться с плохим прогнозом течения рака почки [12, 15, 16].

W.H. Costa et al. (2012) выявили, что около 50 % раков почки экспрессировали CD133. Y. Zhang et al. (2013) обнаружили экспрессию CD133 в 21 % случаев почечно-клеточных опухолей. Ряд исследователей указывают, что высокая экспрессия CD133 может быть благоприятным прогностическим фактором [16–19]. Однако G. Feng et al. (2014) отметили высокий риск рецидивирования и развития метастазов у пациентов с повышенным уровнем матричной РНК гена CD133 в крови [20]. Предполагается, что CD133-позитивные клетки в почечно-клеточном раке поддерживают клеточную популяцию опухоли и служат источником дифференцированных злокачественных клеток [21].

Высокая экспрессия CA-IX связана с благоприятным прогнозом при локализованном и метастатическом ПКР [22]. Было установлено, что уровень экспрессии CA-IX обратно пропорционален риску метастазирования (р = 0,036) и высокая экспрессия CA-IX предполагает лучшую выживаемость даже после учета таких факторов, как Т-стадия, шкала Fuhrman и общее состояние пациента (все р ≤ 0,005) [23]. Низкая экспрессия CA-IX (≤ 85 %) ассоциируется с неблагоприятным исходом у больных с метастатическим ПКР (отношение рисков [OR]: 3,10; р 3.0.co;2-e.

5. Ramis-Conde I, Chaplain MA, Anderson AR, Drasdo D. Multiscale modelling of cancer cell intravasation: the role of cadherins in metastasis. Phys Biol. 2009;6(1):016008. doi: 10.1088/14783975/6/1/016008.

6. Mizrak D, Brittan M, Alison M. CD133: molecule of the moment. J Pathol. 2008;214(1):3-9. doi: 10.1002/path.2283.

7. Li Z. CD133: a stem cell biomarker and beyond. Exp Hematol Oncol. 2013;2(1):17. doi: 10.1186/2162-3619-2-17.

8. Tostain J, Li G, Gentil-Perret A, Gigante M. Carbonic anhydrase 9 in clear cell renal cell carcinoma: a marker for diagnosis, prognosis and treatment. Eur J Cancer. 2010;46(18):3141-3148. doi: 10.1016/j.ejca.2010.07.020.

9. Knebelmann B, Ananth S, Cohen HT, Sukhatme VP. Transforming growth factor alpha is a target for the von Hippel-Lindau tumor suppressor. Cancer Res. 1998;58(2):226-231.

10. Ramp U, Reinecke P, Gabbert HE, Gerharz CD. Differential response to transforming growth factor (TGF)-alpha and fibroblast growth factor (FGF) in human renal cell carcinomas of the clear cell and papillary types. Eur J Cancer. 2000;36(7):932-941. doi: 10.1016/s0959-8049(00)00030-7.

11. Chudek J, Schullerus D, Wilhelm M, Kovacs G. Lack of interleukin 6 (IL-6) and transforming growth factor alpha (TGF-alpha) expression in chromophobe renal cell carcinomas. Br J Cancer. 1998;78(9):1162-1164. doi: 10.1038/bjc.1998.647.

12. Shimazui T, Kojima T, Onozawa M, et al. Expression profile of N-cadherin differs from other classical cadherins as a prognostic marker in renal cell carcinoma. Oncol Rep. 2006;15(5):1181-4. doi: 10.3892/or.15.5.1181.

13. Markovic-Lipkovski J, Brasanac D, Müller GA, Müller CA. Cadherins and integrins in renal cell carcinoma: an immunohistochemical study. Tumori. 2001;87(3):173-178. 14. Behnes CL, Hemmerlein B, Strauss A, et al. N-cadherin is differentially expressed in histological subtypes of papillary renal cell carcinoma. Diagn Pathol. 2012;7:95. doi: 10.1186/17461596-7-95.

15. Zhou N, Lu F, Liu C,etal. IL-8 inducestheepithelial-mesenchymal transition of renal cell carcinoma cells through the activation of AKT signaling. Oncol Lett. 2016;12(3):1915-1920. doi: 10.3892/ ol.2016.4900.

16. Conant JL, Peng Z, Evans MF, et al. Sarcomatoid renal cell carcinoma is an example of epithelial-mesenchymal transition. J Clin Pathol. 2011;64(12):1088-1092. doi: 10.1136/jclinpath-2011-200216.

17. Costa WH, Rocha RM, Cunha IW, et al. CD133 immunohistochemical expression predicts progression and cancer-related death in renal cell carcinoma. World J Urol. 2012;30(4):553-558. doi: 10.1007/s00345-011-0769-x.

18. Cheng B, Yang G, Jiang R, et al. Cancer stem cell markers predict a poor prognosis in renal cell carcinoma: a meta-analysis. Oncotarget. 2016;7(40):65862-65875. doi: 10.18632/oncotarget.11672.

19. Matak D, Szymanski L, Szczylik C, et al. Biology of renal tumour cancer stem cells applied in medicine. Contemporary Oncology. 2015;19(1A): A44-A51. doi: 10.5114/wo.2014.47128.

20. Feng G, Jiang F, Pan C, et al. Quantification of peripheral blood CD133 mRNA in identifying metastasis and in predicting recurrence of patients with clear cell renal cell carcinoma. Urol Oncol. 2014;32(1):44.e9-14. doi: 10.1016/j.urolonc.2013.06.003.

21. Al-Lamki RS, Wang J, Yang J, et al. Tumor necrosis factor receptor 2-signaling in CD133-expressing cells in renal clear cell carcinoma. Oncotarget. 2016;7(17):24111-24124. doi: 10.18632/ oncotarget.8125.

22. Zhang BY, Thompson RH, Lohse CM, et al. Carbonic anhydrase IX (CAIX) is not an independent predictor of outcome in patients with clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) after longterm follow-up. BJU Int. 2013;111(7):1046-1053. doi: 10.1111/ bju.12075.

23. Bui MH, Seligson D, Han KR, et al. Carbonic anhydrase IX is an independent predictor of survival in advanced renal clear cell carcinoma: implications for prognosis and therapy. Clin Cancer Res. 2003;9(2):802-11.

24. Phuoc NB, Ehara H, Gotoh T, et al. Prognostic value of the co-expression ofcarbonicanhydraseIX and vascularendothelial growth factor in patients with clear cell renal cell carcinoma. Oncol Rep. 2008;20(3):525-530. doi: 10.3892/or_00000037.

25. Ingels A, Hew M, Algaba F, et al. Vimentin over-expression and carbonic anhydrase IX under-expression are independent predictors of recurrence, specific and overall survival in non-metastatic clear-cell renal carcinoma: a validation study. World J Urol. 2017;35(1):81-87. doi: 10.1007/s00345-016-1854-y

Статья опубликована в журнале "Урологические ведомости". Номер №4/2017 стр. 5-19

Медицинский эксперт статьи

Сегодня многие задаются вопросом, что представляют собой опухолевые клетки, какова их роль, представляют ли они опасность и приносят ли пользу, или исключительно направлены на уничтожение макроорганизма? Давайте разберемся в этом вопросе.

Трансформированные клетки, которые образуют злокачественную опухоль. Клетки претерпевают многочисленные изменения. Эти изменения ощутимы на морфологическом, химическом, биохимическом уровне. Некоторые видны даже невооруженным глазом. Обнаружение других же требует специального оборудования. Все зависит от типа и локализации.

Отличительной чертой является способность беспредельно увеличивать свою биомассу, что обусловлено нарушением апоптоза (обеспечивает программированную гибель). Заканчивается такой рост только вместе с гибелью человека.

Отличие опухолевой клетки от нормальной

Существует система клеточного апоптоза, который представляет собой запрограммированную гибель клеточного звена. Обычно клетка, прошедшая свой жизненный цикл, погибает. На ее месте со временем развивается новая субпопуляция клеточного цикла. Но при раковой трансформации такой естественный механизм нарушается, в результате чего эта клетка не погибает, а продолжает расти и функционировать в организме.

Именно такой внутренний механизм и является базовой основой формирования опухоли, обладающей тенденцией к бесконтрольному и неограниченному росту. То есть, по сути, подобного рода клеточная структура представляет собой клетку, не способную к гибели, и обладающую неограниченным ростом.

[1], [2], [3], [4], [5], [6], [7], [8]

Клеточный атипизм и атипичные клетки

Под атипичными клетками подразумевают клетки, подверженные мутации. Чаще всего атипичные клетки образуются под действием различных внешних факторов, или наследственности путем их трансформации из стволовых клеток. Чаще всего пусковым фактором развития опухолевой клетки является специфический ген, который кодирует гибель клетки. Некоторые потенциально онкогенные вирусы, например ретровирусы, герпесвирусы, способны вызывать трансформацию стволовых клеток в раковые.

Клеточный атипизм представляет собой собственно процесс трансформации, которому подвергаются здоровые клетки. Этот процесс включает в себя комплекс химических и биохимических процессов. Мутация осуществляется при условии нарушений иммунной системы, в особенности при аутоиммунных заболеваниях, при которых функция иммунной системы трансформируется таким образом, что он начинает вырабатывать антитела, направленные против клеток и тканей собственного организма. Развитию клеточного атипизма способствует ухудшение естественных защитных способностей организма, в частности, при нарушении активности Т-лимфоцитов (киллеров), нарушаются процессы гибели клеток, что приводит к их злокачественному перерождению.

[9], [10], [11], [12], [13], [14], [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21]

Канцерогенез

Процесс потенциального разрастания тканей, что никаким образом не ассоциировано с нормальным состоянием организма. Канцерогенез подразумевает процесс перерождения нормальной клетки в опухолевую, которая есть локальным образованием, однако вовлекается весь организм. Характеристика - опухоли могут давать метастазы, бесконечно разрастаться.

[22], [23], [24], [25], [26], [27], [28], [29]

Раковая клетка под микроскопом

В основе развития раковой клетки лежит резкое увеличение ядра. Раковую клетку легко обнаружить под микроскопом, поскольку ядро в ней может занимать большую часть цитоплазмы. Также ярко выражен митотический аппарат, причем заметны его нарушения. В первую очередь обращает на себя внимание наличие хромосомных аббераций, нерасхождения хромосом. Это приводит к образованию многоядерных клеток, увеличению и утолщению ядра, переходу их в фазу митотического деления.

Также под микроскопом можно обнаружить глубокие инвагинации ядерной мембраны. При электронной микроскопии видны внутриядерные структуры (гранулы). Также в ходе световой микроскопии можно обнаружить потерю четкости контуров ядра. Ядрышки могут сохранять нормальную конфигурацию, могут увеличиваться к количественном и качественном отношении.

Происходит набухание митохондрий. При этом происходит уменьшение количества митохондрий, нарушаются митохондральные структуры. Также наблюдается диффузное расположение рибосом относительно эндоплазматической сети. В некоторых случаях возможно полное исчезновение аппарата Гольджи, но в некоторых случаях возможно и его гипертрофия. Происходит также изменение субклеточных структур, например меняется структура, внешний вид лизосом, рибосом. При этом происходит неодинаковая степень дифференциации клеточных структур.

В ходе микроскопии можно выявить низкодифференцированные и высокодифференцированные опухоли. Низкодифференцированные опухоли представляют собой бледные клетки, в состав которых входит минимальное количество органелл. Большую часть клеточного пространства занимает клеточное ядро. При этом все субклеточные структуры имеют различную степень зрелости и дифференциации. Для высокодифференцированных опухолей характерно сохранение исходной тканевой структуры.

[30], [31], [32], [33], [34], [35], [36]

Свойства и особенности опухолевых клеток

Если клетка становится опухолевой, нарушает ее генетическая структура. Это влечет за собой репрессионные процессы. В результате дерепрессии других генов происходит появление модифицированных протеинов, изоферментов, а также происходит клеточное деление. Это может изменить интенсивность генного и ферментного функционирования. Часто наблюдается репрессия белковых компонентов. Ранее они отвечали за специализацию клетки, активировались депрессией.

Элементы, выступающие в качестве триггеров, инициирующих патологический процесс. Есть предположение относительно того, что внедрение химических веществ осуществляется непосредственно в ДНК и РНК клеток. Это способствует нарушению созревания, развивается увеличение клеточной проницаемости, в результате чего потенциально онкогенные вирусы способны проникать в клетку.

Также пусковыми механизмами могут стать и некоторые физические факторы, такие как повышенный уровень радиации, облучение, механические факторы. В результате их воздействия происходит повреждение генетического аппарата, нарушение клеточного цикла, мутации.

Резко увеличивается потребление аминокислот, увеличивается анаболизм, тогда как катаболические процессы снижаются. Резко увеличивается гликолиз. Также происходит резкое снижение числа дыхательных ферментов. Наблюдается также изменение антигенной структуры опухолевой клетки. В частности, она начинает продуцировать белок альфа-фетопротеин.

Наиболее простым способом диагностики онкологического заболевания является сдача анализа крови на выявление онкомаркеров. Исследование проводится довольно быстро: 2-3 дня, в случае экстренной необходимости может выполниться за 3-4 часа. В ходе анализа выявляют специфические маркеры, которые указывают на протекание в организме онкологических процессов. По виду выявленного маркера можно говорить о том, какой вид рака протекает в организме, и даже определить его стадию.

Следует понимать, что клетка не способна к гибели. Она также может давать патологические метастазы. Также характеризуется нарушением синтетических процессов, интенсивно поглощает глюкозу, быстро расщепляет белки и углеводы, изменяет действие ферментов.

[37], [38]

Сама суть трансформационных изменений – активация синтеза нуклеиновых кислот. Стандартный комплекс претерпевает существенные изменения. Редуцируется синтез ДНК-полимеразы-3, которая отвечает за синтез новой ДНК на базе нативной структуры. Вместо этого увеличивается синтез аналогичных структур 2 типа, которая способна восстанавливать ДНК даже на основании денатурированной ДНК. Именно это и обеспечивает специфику рассматриваемых элементов.

Наиболее известным является рецептор эпидермального фактора роста, который представляет собой трансмембранный рецептор. Происходит активное взаимодействие его с эпидермальными факторами роста.

Любая трансформация влечет за собой изменение генотипа. Наглядно это выражается в изменениях, которые отражены на фенотипическом уровне. Любое изменение подобного рода является чужеродным для организма. Это подразумевает чрезмерную агрессивность иммунной системы человека, которая сопровождается атакой и разрушением собственных тканей организма.

Экспрессия опухолевых клеток

Экспрессия объясняется несколькими причинами. В первичный канцерогенез вовлекается всего одна клетка, но иногда может наблюдаться и одновременное вовлечение в этот процесс нескольких клеток. Затем развивается опухоль, происходит ее рост и размножение. Часто процесс сопровождается спонтанными мутациями. Опухоли приобретают новые свойства.

Отличительной чертой является способность к экспрессии генов, которые выступают в качестве факторов роста для опухоли. Они полностью изменяют обменные процессы исходной клетки, подчиняя ее своим потребностям, выступая своеобразным паразитом.

[39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]

Для активного клеточного деления, требуется присутствие в крови, постоянная экспрессия фактора, подавляющего (репрессирующего) активность гена.

[48], [49], [50], [51], [52], [53], [54], [55], [56], [57], [58]

В ходе дифференциации мутированной ткани, она утрачивает способность к экспрессии редуцирующего гена, который отвечает за программированный аппоптоз. Утрата этой способности, лишает соответствующую структуру возможности прекратить свое существование. Соответственно, она непрерывно растет и размножается.

[59], [60], [61], [62], [63]

Пролиферация опухолевых клеток

Пролиферация - показатель разрастания, определяет тяжесть и стадию. Наблюдается функциональная анаплазия. У быстроастущих опухолей полностью утрачиваются все исходные свойства ткани.

Показатель зависит от места локализации. Определяется по экспрессии Ки – 67. Выражается в процентах путем определения соотношения между количеством нормальных клеток и количеством опухолевых клеток. Выражается в процентах, где 1 % - минимальное количество, ранняя стадия опухолевого процесса. 100% - максимальная стадия, как правило, обнаруживается при летальном исходе.

Представляют собой трансформированные клетки, которые подверглись мутационным процессам. Также в этих клетках ярко выражена способность к трансформации основных свойств исходной клетки. Отличительной чертой является неспособность к гибели и способность к неограниченному росту.

Прежде всего, необходимо знать, что этот феномен являет собой не что иное, как перерожденная клетка человеческого организма, которая в силу различных причин подверглась злокачественной трансформации. Этому процессу потенциально может подлежать практически любая здоровая клетка человеческого организма. Главное – наличие триггерного фактора, который запустит механизм трансформации (канцерогенез). В качестве таких факторов может выступать вирус, повреждение клеточной или тканевой структуры, наличие специального гена, кодирующего раковое перерождение.

Циркулирующие опухолевые клетки

Основная особенность такой клетки состоит в изменении ее биохимического цикла. Происходит изменение ферментативной активности. Также стоит отметить тенденцию к уменьшению количества ДНК – полимеразы 3, которая использует все компоненты нативной ДНК клетки. Также существенно меняется синтез. Резко увеличивается синтез белков, как в качественном, так и в количественном отношении. Также представляет определенный интерес наличие в раковых клетках крупноядерного белка веретена. В норме содержание этого белка не должно превышать 11%, при опухолях число возрастает до 30%. Происходит изменение метаболической активности.

[64], [65], [66], [67], [68], [69], [70], [71], [72], [73]

Стволовые опухолевые клетки

Можно сказать, что это первичные, не дифференцированные структуры, которые в дальнейшем будут подвергаться дифференциации функций. Если же такая клетка подвергается мутации, и превращается в раковую, она становится источников метастаз, поскольку свободно перемещается с током крови, и способна дифференцироваться в любую ткань. Живет долго и медленно пролиферируется. При пересадке имеющему низкий иммунитет (иммунодефицит), способна вызвать развитие злокачественного новоообразования

Апоптоз опухолевых клеток

Основная проблема опухолевой клетки - в ней нарушены процессы апоптоза (запрограммированной гибели, не способна к гибели, и продолжает постоянно расти и размножаться). Существует ген, который инактивирует ген, придающий клетке бессмертность. Это позволяет запустить вновь процессы апоптоза, в результате чего можно наладить нормальные клеточные процессы, и вернуть клетку в нормальное состояние, вызвать ее гибель.

[74], [75], [76], [77], [78], [79], [80], [81]

Дифференцировка опухолевых клеток

Опухолевые клетки дифференцируются в зависимости от того, в состав каких тканей она входит. Названия опухолей также зависят от названий ткани, в состав которой они входят, а также от того органа, который подвергся опухолевому превращению: миома, фибромиома, эпителиальная, соединительнотканная опухоль.

[82], [83], [84], [85], [86], [87], [88], [89], [90]

Задуманные и разработанные эксперименты: RCG DSD NPK. Выполнил эксперименты: RCG. Проанализированы данные: RCG DSD JLB. Используемые реагенты / материалы / инструменты анализа: CID JLB NPK. Написал документ: RCG JLB NPK.

Krüppel-подобный фактор 6 (KLF6) является эволюционно консервативным и повсеместно выраженным белком, который принадлежит к семейству регуляторов транскрипции млекопитающих Sp1 / KLF. Хотя KLF6 является транскрипционным фактором и содержит сигнал ядерной локализации, он не систематически расположен в ядре, но он был обнаружен в цитоплазме нескольких тканей и клеточных линий. Следовательно, до сих пор не полностью урегулировано, связана ли функция супрессора опухолей с KLF6 с его способностью регулировать гены-мишени.

В этом исследовании мы проанализировали экспрессию KLF6 и субклеточное распределение иммуногистохимией в нескольких нормальных и опухолевых тканях в формате микрочипов, представляющих пятнадцать человеческих органов. Результаты показывают, что, хотя как ядерное, так и цитоплазматическое распределение KLF6 обнаруживается в нормальных грудных тканях, карциномы молочной железы выражают KLF6, которые в основном обнаруживаются в цитоплазме. Экспрессия KLF6 была дополнительно проанализирована в тканях молочной железы, сверхэкспрессирующих онкопротеины ERBB2, что связано с плохим прогнозом болезни и выживанием пациента. Анализ 48 протоковых карцином показал значительную популяцию, экспрессирующую KLF6 преимущественно в ядерном отделении (X2 p = 0,005, Fisher p = 0,003). Более того, эта картина экспрессии напрямую коррелирует с ранними стадиями и небольшими протоковыми опухолями молочной железы и связана с метастатическими событиями в лимфатических узлах.

Данные согласуются с предпочтительной локализацией KLF6 в ядерном отделении на ранней стадии и небольших гиперэкспрессирующих клетках грудной клетки грудной клетки HER2-ERBB2, также представляющих метастатические явления в лимфатическом узле. Таким образом, опухолевый супрессор KLF6 может представлять собой нового кандидата молекулярных маркеров для прогноза опухоли и / или потенциальную мишень для стратегий терапии.

Krüppel-подобный фактор 6 (KLF6) относится к большому семейству транскрипционных факторов Sp1 / KLF млекопитающих, которые играют критическую роль в регулировании ключевых клеточных функций, начиная от дифференцирования до пролиферации и апоптоза [1], [2], [3], [4 ]. KLF6 является эволюционно консервативным и повсеместно выраженным белком, который был идентифицирован как активатор специфических для беременности генов [5], [6], [7]. В нескольких независимых отчетах было предложено, что KLF6 является продуктом гена-супрессора опухоли из-за понижающей регуляции экспрессии KLF6 или частых соматических инактивирующих мутаций, были обнаружены в гене klf6 при раке предстательной железы, колоректальных опухолях, глиобластоме, гепатоцеллюлярной карциноме и опухолях, полученных из легких [8], [ 9], [10], [11], [12], [13], [14], [15]. Тем не менее, в ряде других исследований установлено, что генетические изменения KLF6 редко наблюдались при различных типах рака человека или, кроме того, экспрессия гена klf6 была усилена в некоторых опухолях [8], [16], [17], [18] , [19], [20], [21].

Позднее сообщалось, что нарушение мишени гена klf6 вызвало раннюю эмбриональную летальность и сильно нарушало пролиферацию эмбриональных стволовых клеток [22]. Кроме того, p21CIP1 / WAF, ген транскрипции-мишени для KLF6 в дифференцированных клетках [12], [23], не был подавлен в klf6 — / — эмбрионах [22]. Самое главное, что в клеточных линиях гепатомы ситуация особенно интересна, поскольку нокдаун KLF6 приводит к дефосфорилированию Rb вместе с понижением регуляции Cyclin D1, что, в свою очередь, сильно нарушает клеточную пролиферацию с остановкой G1-S [24]. Таким образом, фенотипы, описанные в klf6 — / — мышах, стволовых клетках и линиях клеток гепатомы, указывают на то, что эндогенный KLF6 необходим для прогрессирования клеточного цикла, тем самым контрастируя с его потенциальной опухолевой супрессорной активностью. В соответствии с этими наблюдениями срыв экспрессии KLF6, опосредуемый siRNA, приводит к уменьшению прогрессирования клеточного цикла клеточных линий гепатокарциномы, и они были более восприимчивы к апоптозу, вызванному повреждением ДНК [25].

С другой стороны, сообщалось, что KLF6 обладает способностью снижать скорость пролиферации клеток за счет увеличения деградации c-Jun за счет зависимого от протеасомы пути от промотора опухоли и передачи пролиферирующих клеток, генерируемых 13-ацетатом и иономицином форбол 12-миристата [26 ]. Совсем недавно индуцирование роста форболом 12-миристата с 13-ацетатом немелкоклеточных клеток немелкоклеточного рака было опосредовано индукцией экспрессии KLF6 после активации PKC [27]. Кроме того, KLF6 опосредует ингибирование активности Cyclin D1 / cdk4, что приводит к ингибированию роста [28]. Повторная экспрессия KLF6 дикого типа в клетки РС-3 предстательной железы и немелкоклеточные раковые клетки, которые переносят мутации потери функции или понижают регуляцию эндогенного гена klf6, соответственно, усиливают подавление роста и апоптоз [29], [ 15].

Текущая доступная информация наглядно демонстрирует участие KLF6 в регуляции клеточной пролиферации и апоптоза, которые могут влиять на развитие опухоли. Однако клеточный контекст и / или биохимическая сигнализация, взаимодействие с конкретными транскрипционными партнерами и / или субклеточное распределение KLF6 могли бы управлять результатом функции KLF6 для различных и противоположных путей опухолей. Таким образом, дифференциальное регулирование KLF6 в конкретной клеточной среде дает правдоподобное объяснение расходящейся информации, опубликованной до сих пор о функции супрессора опухоли KLF6. В связи с этим Го и коллеги продемонстрировали снижение связывания KLF6 с его ДНК-связывающей последовательностью на генах-ингибиторах трофического фактора-2 (TFPI-2) из-за гиперметилирования CpG в высокоинвазивных клеточных линиях рака молочной железы, что указывает на супрессор опухоли функции KLF6 [30]. Однако опосредуемое siRNA нокдаун эндогенного KLF6 в клеточной линии, вызванной раком молочной железы MCF7, приводит к уменьшению пролиферации клеток [25].

Рак молочной железы является наиболее распространенным злокачественным, клинически неоднородным заболеванием у женщин, а появление метастатических событий на отдаленных участках, возникших в первичной опухоли, является основной причиной смерти. Характеристика агрессивности опухолей у пациентов с раком молочной железы находится в изучении как клинических, так и патологических параметров, установленных медицинскими критериями, такими как размер опухоли, состояние подмышечных лимфатических узлов, гистологический ранг и ангио-инвазия. Однако эти клинические и патологические параметры, по-видимому, недостаточно точны для прогноза болезни и последующего лечения. Большое количество белков было сообщено как потенциальные маркеры молекулярного прогностического действия, хотя некоторые из них, такие как uPA / PAI1, экспрессия стероидных рецепторов и амплификация гена HER-2 / neu и экспрессия белка были установлены на клиническом уровне (см. [31] , [32], [33], [34], [35], [36]).

В семействе транскрипционных факторов Sp1 / KLF только KLF4 и KLF5 были дополнительно исследованы в контексте среды опухоли молочной железы. Уровень транскрипта и белка KLF4 увеличивается при прогрессировании опухоли молочной железы, и ее ядерная локализация связана с агрессивным фенотипом на ранних стадиях опухолей молочной железы [37], [38]. В противоположном случае транскрипт KLF5 снижается в различных линиях клеток рака молочной железы главным образом вследствие хромосомной делеции или деградации белка KLF5 по протеасом-зависимому пути [39], [40], [41]. Однако высокая экспрессия KLF5 в образцах рака молочной железы напрямую коррелировала с клеточной пролиферацией in vivo и уровнем экспрессии HER-2, тогда как у пациентов была более короткая безрецидивная выживаемость и общее время выживания, чем у пациентов с более низкой экспрессией KLF5 [42].

В качестве важного шага для получения знаний о функции KLF6 в опухолях молочных желез была проанализирована картина экспрессии и субклеточное распределение белка KLF6 в образцах рака молочной железы человека наряду с экспрессией ERBB2 в качестве маркера агрессивности опухоли. Интересно отметить, что KLF6 был широко обнаружен в ядре гиперэкспрессирующих опухолевых клеток HER-2 / ERBB2, тогда как он был главным образом цитоплазматическим в нормальной ткани. Более того, эта картина экспрессии KLF6 имеет тенденцию ассоциироваться с опухолями молочной железы малого размера и стадии I, а также с метастазами подмышечных лимфатических узлов.

Чтобы определить структуру белка KLF6 и его субклеточного распределения в нормальных и опухолевых тканях молочной железы с помощью иммуногистохимии, специфичность антител контролировали с использованием участков ткани плаценты человека с учетом высокого уровня экспрессии KLF6 в этом органе. Специфичность моноклонального антитела против KLF6 (клон 2С11) ранее характеризовалась иммунопреципитацией и Вестерн-блоттингом [26]. Для иммуногистохимических анализов специфичность этого антитела оценивали по отношению к специфичности коммерческого поликлонального антитела против KLF6 Zf-9. Оба антитела развивали аналогичные образцы окрашивания в парафиновых сегментах семян плаценты с помощью иммуногистохимических анализов, демонстрируя ядерную и цитоплазматическую локализацию KLF6 в периферических хорионических клетках ворсинок и во внутренних клетках плаценты (рис.1A). Этот результат указывает на то, что специфичность моноклонального антитела (клон 2С11) пригодна для обнаружения KLF6 в тканевых срезах иммуногистохимией при данных аналогичных результатах, чем коммерческое антицикловое антитело против Zf9. Даже аналогичные образцы окрашивания антител были обнаружены в участке ткани карциномы молочной железы (рис. S1).

Иммуногистохимические анализы проводили, как описано в материалах и методах. Конкретное пятно показано как коричневый осадок, а ядра — синим, контрастируемым с гематоксилином. Увеличение — 600 ×. A. Образец пятна, полученный для коммерческого анти-KLF6-поликлонального антитела (Zf9, верхний) и для встроенного в организм моноклонального антитела против KLF6 (клон 2C11, нижний) в терминальных участках ткани плаценты. B. Фоновый контроль вторичного комплекса обнаружения EnVision® System Peroxidase Labeled Polymer (Дако, Карпинтайра, США). Секцию ткани плаценты инкубировали только с буфером для разведения первичных антител и упомянутым выше вторичным комплексом обнаружения.

Затем образец белка KLF6 анализировали с помощью иммуногистохимических анализов в нескольких участках нормальной и опухолевой ткани, полученных из образцов, встроенных в парафин, которые были обнаружены в массиве. Результаты ясно показали специфическое и значительное окрашивание для KLF6 как в нормальных, так и в опухолевых тканях с различной интенсивностью. Также субклеточное распределение KLF6 было ограничено участком цитоплазмы в опухолевых тканях в отличие от равномерного ядерного и цитоплазматического распределения для каждого гистологического нормального аналога (рис. S2 и таблица S1). Эти результаты хорошо согласуются с предыдущими исследованиями, показывающими повсеместную экспрессию KLF6 на уровне мРНК [6], [7], и в этой работе показано, что значительное количество белка KLF6 в основном накапливается в цитоплазматическом отделении образцов рака , Интересно, что это выражение и структура подклеточной распределения не наблюдались в срезах тканей молочной железы. В отличие от других типов опухолевых тканей экспрессия KLF6 была в значительной степени ограничена и почти исключительно в ядерном отделении в высоком проценте тканей этих опухолей молочной железы (рис.2, левая панель, L1). Подобное распределение KLF6 было обнаружено в разных партиях микромассивов опухолевой ткани (рис.2, левая панель, L2a-c). Эти результаты указывают на специфическую регуляцию полипептида KLF6 в контексте опухоли молочной железы, что приводит к преимущественной локализации в ядре.

Иммуногистохимические анализы в двух сериях опухолевых тканей Microarray от DAKO (чешуйчатые тканевые опухолевые ткани человека, T1064, Дако, США). Ткани инкубировали с анти-KLF6 (клон 2C11, левая панель) или антителами против ERBB2 (правая панель). Лот 1 (# 00071) представлен на панели L1 и Лот 2 (# 00111) в панелях L2a, L2b и L2c. Пятна KLF6 и ERBB2 сфотографировались в эквивалентной области секции ткани при 400 × увеличения.

Экспрессия ERBB2 представляет собой хорошо известный маркер агрессивности опухолей молочной железы, и ее сверхэкспрессия связана с худшей прогностической и сниженной выживаемостью [31]. Чтобы оценить взаимосвязь экспрессии белка KLF6 со степенью злокачественности каждой опухоли молочной железы, проанализированной в этом исследовании, уровень экспрессии ERBB2 определяли в обоих участках микрочипов опухолевых тканей. Интересно, что хотя уровень экспрессии ERBB2 варьировался в разных образцах опухоли молочной железы, ткани, имеющие ядерную локализацию KLF6, демонстрируют более высокую экспрессию ERBB2, что наблюдается в обеих участках ткани (рис.2, правая панель). Важно подчеркнуть, что экспрессия ERBB2 была проанализирована на соседней области ткани, где был обнаружен KLF6.

Как показано ранее, ядерная локализация KLF6, наблюдаемая в клетках секций опухоли молочной железы, соответствует высоким уровням экспрессии ERBB2. Эти результаты побудили нас расширить анализ распределения клеток KLF6 на широкую популяцию образцов опухоли молочной железы. Таким образом, был проанализирован независимый тканевый микрочип, который содержит фрагменты тканей из 60 клинических случаев, включающих ассортимент типов опухолей молочной железы человека (LandMark ™). Клинические данные пациента, включая размер опухоли, гистологический ранг и стадию, а также анализ лимфатических узлов для каждого случая, суммированы в таблице 1 и подробно описаны клиническим случаем в таблице S2.

Одна лобулярная ткань карциномы молочной железы была разрушена и, таким образом, не включена в анализ.

Иммуногистохимические анализы показали, что эпителиальные клетки всей популяции опухолей молочной железы развили специфическое окрашивание для KLF6 (левая панель 3, таблица 2 и таблица S3). Интересно отметить, что интенсивность окрашивания была последовательно выше, чем образца ткани фиброаденомы, которая выражала низкие уровни KLF6, которые были систематически обнаружены в цитоплазматическом отделении. Важно отметить, что никакого ядерного окрашивания KLF6 не было обнаружено в ткани молочной железы фиброаденомы (рис. 3, строка I, левая панель, таблица S3). Этот образец ткани использовался в качестве контрольной ткани, потому что архитектура и клеточный фенотип непатологической ткани молочной железы относительно консервативны, как в нормальной ткани. После этого иммуноокрашивание KLF6 также было положительным в цитоплазматическом отделении общей массы опухолей молочной железы. Что еще более важно, 57,6% (34/59) анализируемых тканей опухолей молочной железы у всего населения показали положительный ядерный иммуногенность для KLF6 (таблица 2A). Этот результат соответствует предыдущим наблюдениям, описанным выше.

Иммуногистохимические анализы в тканевом микромассе LandMark LD Breast TMA (Амбион, Остин, Техас, США). Ткани инкубировали с антителами против KLF6 и анти-ERBB2. Левая панель снимков колонок KLF6 и ERBB2 имеет 400-кратное увеличение. Квадрат в каждый 400 × рисунок показывает площадь, сфотографированную при 1000 × и показанную на правой панели каждого столбца. Микрофотографии иммуностаина для KLF6 и ERBB2 были взяты из эквивалентных областей ткани. Горизонтальные панели представляют собой экспрессию KLF6 и ERBB2 в ткани фиброаденомы (i) и четыре типичных случая как для положительного ядерного KLF6, так и для ERBB2 (ii), отрицательного ядерного KLF6 и положительного ERBB2 (iii), положительного ядерного KLF6 и отрицательного ERBB2 (iv) , и оба отрицательных ядерных KLF6 и ERBB2 (v). Ткани в ii-v соответствуют случаям 40, 18, 45 и 6 соответственно, описанным в таблицах S2 и S3.

Помимо анализа экспрессии KLF6, были проведены иммуногистохимические анализы для определения статуса маркера агрессивности HER2-ERBB2 в исследуемой популяции опухоли молочной железы. Положительный критерий отсечения HER2-ERBB2 указан в материалах и методах. Результаты показали, что 54,2% (32/59) популяции опухолей молочной железы сверхэкспрессируют HER2-ERBB2 (таблица 2A). Важно отметить, что аномальные высокие уровни HER2-ERBB2 присутствуют примерно в 18-20% случаев рака молочной железы ([43] и ссылки на них). Тем не менее, многие исследователи согласны с тем, что он усиливается и сверхэкспрессируется в 32-55% поражений DCIS [33], [34], [36]. В этом смысле процент сверхэкспрессирующих тканей опухоли молочной железы HER-ERBB2, полученных в настоящей работе, соответствует показателю распространенности, о котором сообщается, кроме того, что популяция опухолей состоит из набора инвазивных и неинвазивных типов опухолей.