Р53 при раке молочной железы

Оценка прогностической ценности р53 требует тестирования большого количества образцов у пациентов, включенных в предполагаемые клинические испытания III фазы. Целью данного исследования было определить, можно ли определить статус р53 с помощью функционального анализа дрожжей р53 с использованием предельных количеств материала, которые обычно могут быть получены в проспективных исследованиях III фазы (особенно, когда химиотерапия назначается до операции). Все пациенты, имеющие клинически ощутимую опухоль, которые могут считаться достаточно большими для проведения биопсии с пробой (опухоль груди размером 2 см), были пригодны для этого исследования. На хирургических образцах (мастэктомия или опухолеремия) были проведены две биопсии для резекта и одна предварительная биопсия. Образцы замораживали, а секции криостата брали для гистологии и тестирования р53. Было включено 30 пациентов. Три образца из 90 не дали никаких продуктов ПЦР p53, вероятно, потому, что эти образцы содержали почти полностью волокнистую ткань. Из 87 образцов, которые можно было протестировать, результаты разреза и резкого биопсии были полностью согласованы в каждом случае. p53 можно было определить у 97% пациентов с помощью двойной биопсии. Восемь из 30 тестируемых опухолей были мутантами для р53 (27%). Статус p53 может быть достоверно определен с помощью анализа дрожжей на отдельных замороженных участках биопсий. Гистологическое исследование перед тестированием р53 необходимо для исключения случаев, когда результат р53 может отражать только статус нормальных клеток в биопсии.

Экспериментальные и клинические исследования показали, что противораковые агенты сильно индуцируют апоптоз (Hickman, 1992; Ellis et al, 1997). p53 является ключевым регуляторным геном в апоптотическом пути, и экспериментальные данные показали, что опухоли, содержащие p53 дикого типа, лучше реагируют на антрациклины, чем р53-мутантные опухоли (Lowe et al, 1993, 1994; Gudas et al, 1996). Напротив, большинство исследований in vitro и in vivo показали, что статус p53 не влияет на ответ на таксаны (Woods et al, 1995; Brown, 1996; Jordan et al., 1996; Perego et al., 1996; Wahl et al, 1996 Lanni et al., 1997; O’Connor et al., 1997; Fan et al, 1998).

В совокупности эти экспериментальные результаты свидетельствуют о том, что статус р53 может помочь предсказать реакцию на химиотерапию антрациклинами или таксанами в клинической практике. В частности, можно сделать гипотезу о том, что мутантные опухоли p53 будут устойчивыми к антрациклину, но чувствительны к таксану. Несколько клинических исследований, посвященных этому вопросу, не продемонстрировали прогностической ценности р53. Два клинических исследования, в которых была оценена последовательность ДНК р53, показали, что статус р53 может быть важным. В первом исследовании было обнаружено, что мутантные опухоли р53 устойчивы к антрациклинам (Aas et al, 1996), а вторая обнаруживает, что мутантные опухоли p53 чувствительны к таксанам (Kandioler-Eckersberger et al., 2000). Однако число пациентов, проанализированных в этих исследованиях, было слишком маленьким для окончательных выводов.

Чтобы окончательно решить этот вопрос при раке молочной железы, мы начали крупное клиническое исследование III фазы (исследование EORTC 10994 / BIG 00-01). Тестирование p53 в контексте клинического испытания фазы III создает серьезные технические и логистические проблемы, заслуживающие комментариев. Во-первых, корреляция одной биологической переменной с ответом на различные методы лечения, минимальный дизайн, чтобы показать прогностический эффект, требует в четыре раза больше пациентов, чем стандартное сравнение двух методов (Peterson and George, 1993). Принимая разумные предположения о вероятных прогностических и лечебных эффектах статуса р53 у пациентов с локально распространенным раком молочной железы, количество пациентов, которые должны были ответить на вопрос p53 / таксана в течение 3 лет, составляет около 1400. Во-вторых, хотя широко доступны иммуногистохимия (IHC) не является лучшим методом оценки статуса p53. Риск ложноположительных и ложноотрицательных результатов выше с IHC, чем секвенирование (Fisher et al, 1994; Sjogren et al, 1996; Duddy et al, 2000). В частности, IHC не обнаруживает мутантов, которые кодируют нестабильные белки (бессмысленные мутации, сращивающие мутации), которые были обнаружены в до 47% мутаций p53 в опухолях молочной железы (Chappuis et al, 1999). Более простые методы на основе структуры ДНК, особенно денатурирующий электрофорез в градиентном геле, являются чувствительными, но требуют секвенирования, чтобы показать, что это изменение не является полиморфизмом или молчаливой мутацией. Секвенирование геномной р53 обычно считается золотым стандартом, против которого следует сравнивать новые методы оценки р53, но полное обнаружение мутаций в фиксированной ткани формалина требует микродиссекции образцов опухолей, отнимающей много времени, когда сотни образцов должны быть протестированы (Хартманн et al., 1997). Мы впервые использовали метод РНК, который обнаруживает функционально важные мутации p53 (Flaman et al, 1995). Мы амплифицируем кДНК р53 с помощью ОТ-ПЦР и затем экспрессируем клонированную ДНК у дрожжей. Если кодируемый р53-белок является диким типом, он активирует транскрипцию репортерного гена. Преимущество этого метода заключается в том, что он тестирует большое количество отдельных клонов, поэтому он может обнаруживать мутантную мРНК р53 в клинических образцах, которые содержат значительное количество нормальной ткани. Также возможно протестировать большое количество образцов, необходимых для ответа на клинические вопросы, такие как роль р53 в реакции таксана. Несмотря на то, что расщепление РНК, опосредованное нонсенсом, затрудняет обнаружение мутаций, ограничивающих цепь, с использованием метода на основе РНК, мы показали, что анализ дрожжей особенно хорош при обнаружении этого типа мутации (Chappuis et al, 1999). В-третьих, сбор образцов таким образом, который сохраняет целостность РНК, является серьезной проблемой в многоцентровом клиническом исследовании. Ранее мы показали, что статус р53 может быть точно определен из замороженных участков разрезных биопсий от опухолей молочной железы (Chappuis et al, 1999). Пациенты с большими оперативными или локально развитыми / воспалительными раками молочной железы будут иметь право участвовать в исследовании EORTC 10994 / BIG 00-01. Нынешняя практика в этой группе пациентов заключается в том, чтобы использовать биохимические проколы, а не биопсии. Цель настоящего исследования состояла в том, чтобы определить, возможно ли тестировать p53 статус опухолей молочной железы с помощью дрожжевого анализа в условиях, сходных с теми, которые относятся к этому клиническому испытанию EORTC.

Разрешение на исследование было предоставлено Комитетом по этике в больницах Женевского университета. Все пациенты дали информированное согласие на участие в исследовании. Мастэктомию или образцы опухолеобразования в группе из 30 пациентов были взяты из операционной в отделение патологии с минимальной задержкой и взяты три биопсии (две эксклюзионные биопсии с иглой 14G и одна пункционная биопсия). Исследование проводилось на хирургически резецированной мастэктомии или образцах опухолеобразования, поскольку этические проблемы исключают множественную выборку опухолей для исследовательских целей у живых субъектов. Биопсии внедряли в ОКТ и немедленно замораживали в 2-метилбутане. Образцы для рутинной диагностики брались параллельно и фиксировались в формалине. Гистологическая оценка всех образцов проводилась одним и тем же патологом (MF Pelte). Анализ дрожжей проводили на замороженных срезах на 100 мкм, по существу, как описано Chappuis et al (1999). мРНК очищали с использованием олиго-dT Dynabeads (Dynal). Общая РНК была очищена с помощью Trizol (Life Technologies). В качестве ПФУ-полимеразы использовали ПФУ-турбо-полимеразу (стратаген). Чтобы исключить снижение достоверности этого фермента, вызванного проприетарной модификацией, мы провели анализ достоверности полимеразы (Flaman et al, 1994). В соответствии с утверждениями изготовителя мы не могли обнаружить разницы в точности Pfu и Pfu turbo (данные не показаны). Поэтому мы использовали турбину Pfu для настоящего исследования. Более высокая процессировка означала, что фрагмент кДНК p53 1 кб можно амплифицировать так же эффективно, как меньшие фрагменты, используемые для раздельной версии дрожжевого анализа (Waridel et al, 1997). Поэтому мы использовали только обычную форму анализа, в которой продукт PCR p53 размером 1 kb был заменен на дрожжевой экспрессирующий вектор pRDI-22 (Waridel et al, 1997).

Секвенирование проводили на минимум четырех плазмидах, спасенных из разных колоний для каждой мутантной опухоли р53. Секвенирующие праймеры были либо IF12, либо IR13 (Chappuis et al, 1999), либо IF216 и IR217 (таблица 1Table 1PCR и секвенирующие праймеры), которые лежат в начале и конце открытой рамки считывания p53 и позволяют упорядочить всю открытую рамку считывания в один запуск на секвенсере Licor 4200L. Каждая плазмида была секвенирована только на одной цепи, но каждая мутация была визуализирована на обеих нитях.

Чтобы испытать образец 17В с помощью микродиссекции, одну замороженную секцию рассекали с помощью лазерного микродиссектора Leica. Геномную ДНК экстрагировали расщеплением протеиназой K, амплифицировали вложенной ПЦР, а экзоны 4-7 секвенировали непосредственно (см. Таблицу 1 для праймеров).

Количественную ПЦР для GAPDH проводили на ПЦР-машине PE5700 с использованием праймеров gaaggtgaaggtcggagtc, gaagatggtgatgggatttc и Taqman probe caagcttcccgttctcagcc. кДНК синтезировали с помощью обратной транскриптазы Superscript (Life Technologies), как и для p53 (Chappuis et al, 1999), за исключением того, что использовали гексамеры и амплифицировали с использованием основного микса Taqman PCR (Perkin-Elmer).

Одним критическим параметром в тесте является фоновое число красных колоний. Это определяет максимально допустимое загрязнение образцов опухолей генетически нормальными клетками. Гистологическое исследование показало, что в большинстве образцов мало или вообще нет нормальной ткани молочной железы, но все они содержали значительное количество генетически нормальных клеток, главным образом фибробластов, воспалительных клеток и эндотелиальных клеток. В образцах часто содержались большие фиброзные бесклеточные области, причем опухолевые клетки присутствовали на небольших островах. Точная оценка количества или доли опухолевых клеток чрезвычайно сложна в таком гетерогенном материале. Наблюдаемое распределение красных колоний было использовано для определения реального фона с помощью клинических образцов. Причинами изменения фона являются такие факторы, как ошибки РНК-полимеразы, артефакты сращивания, ошибки обратной транскриптазы, ошибки полимеразы Пфу, изменение количества входной РНК, артефакты клонирования ремонта дефектов, рекомбинация в локусе репортера и генетические супрессоры дрожжей leu2- 3112. Если предположить, что они происходят по существу случайным образом, мы должны увидеть два наложенных распределения в результатах: нормально распределенная популяция, полученная из образцов дикого типа, наложенная на более плоское распределение, полученное из образцов мутантов р53. Последнее может принимать любое значение выше фона, в зависимости от количества нормальной ткани в образце. Это именно то, что наблюдается. Рисунок 1Настроенная 1H-диаграмма, показывающая распределение процента красного для дрожжевых анализов на замороженных участках опухолей молочной железы. Средний фон с образцами дикого типа составляет 5% красных колоний (см. Текст).

Мутации ТР53 — одно из самых частых событий в клетках злокачественных новообразований. По различным данным, от 50 до 80% солидных опухолей имеют различные повреждения ДНК в данном гене, около 90% из которых — миссенс мутации, то есть ведут к изменению структуры белка.

Апоптоз и злокачественные опухоли

Образование любой злокачественной опухоли сопряжено с нарушением механизмов апоптоза (программируемой клеточной гибели), которые контролируются белком р53. Его нормальное функционирование препятствует бесконтрольному делению неполноценных клеток. Если в результате какого-либо воздействия (облучения, химических веществ), в клетке возникают повреждения молекулы ДНК, белок р53 остановит ее деление до устранения повреждения, либо активирует ее программируемую гибель до того, как она успеет поделиться.

Данный механизм работает до тех пор, пока ген ТР53 имеет нормальную структуру. Когда в нем возникают мутации, в клетке накапливается мутантный белок, который не может выполнять свою основную функцию. Это нарушает механизмы включения апоптоза, что проявляется развитием новообразований, а при их существовании — способствует возникновению резистентности опухолевых клеток к проводимой химиотерапии.

Методы диагностики

На сегодняшний день существует несколько основных методов, позволяющих выявить наличие повреждений ДНК в гене ТР53:

Секвенирование. В результате анализа происходит расшифровка последовательности целого гена, что позволяет найти все существующие в нем мутации. Они могут возникать как в нормальных клетках, увеличивая вероятность злокачественной трансформации, так и в опухолевых, что предопределяет дальнейшее прогрессирование новообразования. Данный метод применяется при подозрении на наследственные синдромы, когда мутации в гене являются инициирующим событием. В остальных случаях существуют значительные сложности с интерпретацией выявленных повреждений ДНК.
Иммуногистохимический анализ (ИГХ). Данный метод исследования является основным в клинической практике. Он позволяет оценить экспрессию в исследуемой ткани белка р53, увеличение концентрации которого говорит о нарушении в работе соответствующего гена и, как правило, сопряжено с высокой пролиферативной активностью клеток (что позволяет дифференцировать дисплазии и злокачественные опухоли) и чаще всего является признаком неблагоприятного прогноза.

Метод ПЦР (полимеразная цепная реакция) для поиска повреждений ДНК в гене ТР53 является несколько устаревшим. В настоящее время используется он очень редко, когда необходимо подтвердить наличие или отсутствие конкретной мутации. Однако в связи с большим их разнообразием, в диагностическом процессе при наличии такой необходимости, в настоящее время предпочтение отдается полногеномному секвенированию.

Иммуногистохимический метод позволяет косвенно оценить состояние гена ТР53 по концентрации белка р53, которая для разных тканей в норме может значительно отличаться. Поэтому заключение о наличии нарушения делает морфолог.

Для проведения ИГХ, на первом этапе выполняется биопсия. Затем полученная ткань фиксируется на стекле, к ней добавляются специфические антитела, меченные красителем. Результаты могут быть оценены при помощи обычного светового микроскопа.

Таким образом, по количеству связанного красителя в ткани можно визуально оценить содержание белка. Система оценки двумерная:

Оценивается интенсивность окраски от 0 до 3 баллов. При этом 0 баллов — окраска отсутствует, а 3 — сильное окрашивание.
Оценивается доля окрашенных клеток, которая в зависимости от числового значения переводится в баллы.

В заключение отметим, что поскольку организм — сложная система, то мутации в одном гене лишь повышают вероятность, но не гарантируют развитие опухоли в организме. Поэтому любое исследование, показавшее то или иное нарушение в работе гена ТР53 должно быть интерпретировано доктором в комплексе с учетом клинической картины и использованного метода.

Как свидетельствуют исследования последних лет, РМЖ является гетерогенным заболеванием [2; 3]. Выявление все новых и новых молекулярно-генетических и иммунногистохимических маркеров и их корреляций позволяет индивидуализировать тактику лечения больных [1]. Ключевыми белками, участвующими в управлении апоптозом, являются белки семейства BCL-2 и супрессор опухолевого роста р53. Частота встречаемости экспрессии BCL2 (BCL2+) составляет, по данным разных авторов, от 54,1 % до 75,7 % [10; 9]. Некоторыми авторами проведены исследования по ассоциации BCL2+ с тем или иным молекулярно-биологическим подтипом РМЖ. Так, например, по данным [4], у 70 % больных ТНР выявлено отсутствие экспрессии BCL2 (BCL2-), что коррелировало с высокой пролиферативной активностью опухоли. Эти же данные о достаточно низкой экспрессии BCL2 подтверждены и в других исследованиях, где, помимо низкого уровня экспрессии BCL2, при ТНР отмечено высокое содержание p53 и высокая частота мутаций BRCA1 [8; 11]. Клинико-морфологическое исследование на материале 61 пациентки [12] выявило, что BCL2+ ассоциировано со старшим возрастом, постменопаузой, люминальным подтипом опухоли (особенно А), отсутствием гиперэкспресии или амплификации гена HER2neu, низкой или средней степенью ее злокачественности. При этом средний возраст больных BCL2+ достоверно выше, чем больных BCL2- (62 года против 53). А вот экспрессия р53 (р53+), по данным литературы, наоборот, связана с негативными рецепторами эстрогенов, HER2neu+ и высокой степенью злокачественности опухоли [5]. Так, повышенная экспрессия Всl-2 при РМЖ коррелирует с наличием в опухоли рецепторов эстрогенов и прогестерона [7]. По мнению Callagy G. и соавторов, это объясняется положительной эстроген-рецептор-зависимой регуляцией экспрессии Bcl-2 [6]. Таким образом, данные литературы по частоте встречаемости и корреляции экспрессии BCL2 и р53 с молекулярно-биологическими подтипами РМЖ носят разрозненный характер и касаются в основном ТНР. Более того, результаты исследований часто мало сопоставимы, ввиду того, что принципы деления РМЖ на подтипы менялись с течением времени (St.Gallen 2011; 2013).

Материалы и методы исследования

Была изучена экспрессия маркеров р53 и bcl-2 в клетках РМЖ 95 пациенток с различными молекулярно-биологическими подтипами с помощью иммуногистохимического метода. Иммуногистохимическое исследование проводили на срезах с парафиновых блоков опухолей, предназначенных для стандартного морфологического исследования. Использованные в работе первичные антитела и их разведения представлены в табл. 1.

Панель использованных в исследовании антител

Нормальный и мутантный тип р53

10 мМ Tris, 1 мМ EDTA (рН 9,0)

10 мМ Tris, 1 мМ EDTA (рН 6,0)

Результаты исследования и их обсуждение

Из 95 пациенток у 26 (27,4 %) был определен люминальный А – подтип, у 33 (34,7 %) – люминальный В – подтип, у 15 – HER2neu+ (15,8 %), у 21 – ТНР (22,1 %). Данные по экспрессии р53 и bcl-2 представлены в табл. 2.

Экспрессия р53 и bcl-2 у больных с различными молекулярно-биологическими подтипами РМЖ

Люминальный А (n = 26)

Люминальный В (n = 33)

* – различия достоверны в отношении люминального А подтипа РМЖ (p ≤ 0,05)

¹ – различия достоверны в отношении люминального В подтипа (p ≤ 0,05)

Рассмотрев соотношение числа положительных случаев по экспрессии p53 к случаям положительной экспрессии bcl-2, выявлено, что наименьшее соотношение (0,25) отмечено при люминальном А молекулярном подтипе, когда при повышении доли опухолей положительных по экспрессии bcl-2 отмечено снижение числа опухолей, позитивно окрашенных антителами к p53. Несколько выше этот показатель отмечен при ТНР и люминальном В – подтипе, составив 0,6 и 0,83 соответственно. Обратная зависимость наблюдалась при Her2+ РМЖ, составив 2, где отмечено преобладание доли опухолей, позитивных по экспрессии p53 над bcl-2+.

Заключение

Таким образом, проведенное исследование подтвердило различие в уровне экспрессии рецепторов белков, участвующих в процессе апоптоза: p53 и BCL-2. Полученные результаты в большинстве своем не противоречат данным литературы. Однако, по нашим данным, уровень экспрессии р53 при люминальных подтипах различен. Если при люминальном А – подтипе он традиционно низкий, то при люминальном В – подтипе, наоборот, высокий и сравним с таковым в гормон-негативных опухолях. На наш взгляд, это объясняется прежде всего неоднородностью люминального В – подтипа. И высокий уровень экспрессии р53 при нем обеспечивается за счет гормон-позитивных опухолей, ассоциированных с гиперэкспрессией или мутацией Her2neu. Скорее всего, именно HER2neu+ статус опухоли наиболее сильно коррелирует с высоким уровнем экспрессии р53, что объясняет его снижение при ТНР. Этот же факт неоднородности люминального В – подтипа объясняет и достоверное снижение экспрессии bcl-2 в люминальных В – опухолях по сравнению с люминальным А – подтипом. Таким образом, полученные результаты предполагают дальнейшие исследования в этом направлении, с целью выявить более специфические различия в молекулярном портрете РМЖ.

Рецензенты:

Шихлярова А.И., д.б.н., профессор, главный научный сотрудник Южного научного центра РАН, г. Ростов-на-Дону.

Апоптоз и злокачественные опухоли

Методы диагностики

Секвенирование. В результате анализа происходит расшифровка последовательности целого гена, что позволяет найти все существующие в нем мутации. Они могут возникать как в нормальных клетках, увеличивая вероятность злокачественной трансформации, так и в опухолевых, что предопределяет дальнейшее прогрессирование новообразования. Данный метод применяется при подозрении на наследственные синдромы, когда мутации в гене являются инициирующим событием. В остальных случаях существуют значительные сложности с интерпретацией выявленных повреждений ДНК.
Иммуногистохимический анализ (ИГХ). Данный метод исследования является основным в клинической практике. Он позволяет оценить экспрессию в исследуемой ткани белка р53, увеличение концентрации которого говорит о нарушении в работе соответствующего гена и, как правило, сопряжено с высокой пролиферативной активностью клеток (что позволяет дифференцировать дисплазии и злокачественные опухоли) и чаще всего является признаком неблагоприятного прогноза.

Оценивается интенсивность окраски от 0 до 3 баллов. При этом 0 баллов — окраска отсутствует, а 3 — сильное окрашивание.
Оценивается доля окрашенных клеток, которая в зависимости от числового значения переводится в баллы.

Р53 при раке молочной железы

Апоптоз и злокачественные опухоли

Методы диагностики

Апоптоз и злокачественные опухоли

Методы диагностики

Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Глухова Е. И., Лукашина М. И., Богатырев В. Н., Барышников А. Ю.