Преобразование в раковые клетки

Как нормальная клетка превращается в раковую (ГЕОРГИЕВ Г.П. , 1999), БИОЛОГИЯ

Открыто более сотни генов, мутации в которых могут способствовать превращению нормальной клетки в опухолевую - это онкогены и гены-супрессоры опухолей. В статье рассмотрены основные функциональные классы, к которым относятся эти гены.

КАК НОРМАЛЬНАЯ КЛЕТКА ПРЕВРАЩАЕТСЯ В РАКОВУЮ

Московский государственный университет

им. М.В. Ломоносова

Рак - это генетическая болезнь, то есть болезнь, связанная с потерей, или повреждением, или активацией, или, наконец, привнесением извне определенных генов. Как известно, ген - это отрезок ДНК, который кодирует тот или иной белок. Последовательность, состоящая из трех нуклеотидов (всего их четыре - A, G, C и Т), кодирует ту или иную аминокислоту, общее число которых равно 20. Последовательность аминокислот в молекуле белка определяет трехмерную пространственную структуру белка и его функцию. Как мы видим, между структурой ДНК (гена) и ее продукта - белка существует прямая связь.

Оказалось, что некоторые вирусы способны в определенных условиях вызывать образование опухолей. Эти вирусы были названы онкогенными вирусами. Вирусы, как правило, содержат очень мало генов - от нескольких генов до нескольких десятков, тогда как в каждой клетке человека присутствует около 100 000 генов. Далее было показано, что из всех генов вируса обычно только один нужен для превращения клетки в опухолевую, то есть для этого нужно появление в клетке лишь одного нового белка. Такие гены были названы онкогенами. У некоторых вирусов это собственные гены вируса (вирусные онкогены), у других вирусов в процессе цикла их развития происходит захват генов хозяина, например генов мыши или человека, и последние выступают в роли онкогенов. Это особенно интересная группа, поскольку в нее входят гены самой клетки, которые функционируют на определенных этапах развития и на их матрице синтезируются нормальные белки.

Возникает вопрос, почему эти нормальные гены начинают индуцировать возникновение опухолей. Есть несколько путей подобной активации онкогена. Прежде всего такая активация может происходить и в вирусе и вне вируса, просто в клетке. Один из путей активации онкогена - структурная мутация, то есть изменение структуры гена, например замена нуклеотида в ДНК, ведущая к замене аминокислоты в белковой цепи и к изменению функции белка. Другой путь - это усиление активности онкогена, то есть усиление синтеза матричных РНК на матрице ДНК и в итоге усиление синтеза белкового продукта онкогена и его накопление в клетке. Активация онкогена может быть результатом увеличения числа копий данного гена в геноме или следствием такой перестройки генома, когда рядом с потенциальным онкогеном появляется новый регуляторный элемент, обеспечивающий его более активную транскрипцию, то есть синтез матричной РНК. Есть и другие способы активации онкогена. Число известных онкогенов непрерывно растет и уже перевалило за 100.

Вскоре после открытия первых онкогенов появились сообщения о существовании генов, утрата или подавление активности которых также приводит к развитию опухолей. Иными словами, белковые продукты этих генов необходимы для того, чтобы не дать клетке превратиться в раковую. Эти гены были названы антионкогенами или генами-супрессорами опухолей (ГСО). Число известных ГСО тоже быстро растет, хотя и уступает числу открытых онкогенов. Итак, есть гены, белковые продукты которых помогают нормальной клетке превратиться в раковую, и гены, белковые продукты которых этому препятствуют. Возникает центральный вопрос, какова природа белковых продуктов онкогенов и ГСО. Оказалось, что она чрезвычайно разнообразна. Основные классы генов и их белковых продуктов, которые могут выступить в роли онкогенов или ГСО, приведены в табл. 1.

Чтобы клетка начала расти и размножаться, нужны специальные сигналы, вырабатываемые обычно другими клетками, а иногда и самой клеткой. Это обычно белковые молекулы, называемые факторами роста (рис. 1). Их производство строго регулируется, но если происходит нарушение регуляции, то факторы могут накапливаться в больших количествах. Они начинают сигнализировать клетке о необходимости расти и делиться. Поэтому некоторые гены, кодирующие факторы роста, могут выступать в роли онкогенов.

Чтобы фактор подействовал, необходим рецептор для данного фактора, расположенный на поверхности клетки-мишени. Когда фактор присоединяется к рецептору, последний активируется, что может в ряде случаев выразиться в ферментативной реакции, например фосфорилировании определенных белков. При некоторых повреждениях рецепторов факторов роста они обретают свойства "зажигаться" при отсутствии своего фактора роста. Такой рецептор будет непрерывно передавать сигнал о необходимости начинать рост, хотя фактор роста и отсутствует. Поврежденный ген, кодирующий такой измененный фактор роста, может выступать в роли онкогена.

Передача сигнала на рост не ограничивается факторами роста и их рецепторами. В передаче такого сигнала участвует много других белков - передатчиков сигнала. Это своего рода клеточное реле. Такая передача часто идет путем фосфорилирования одним белком второго, вторым третьего и т.д. Гены, кодирующие участников этих цепей, могут выступать в роли онкогенов.

Цепи передачи сигналов заканчиваются в клеточном ядре. Там происходит активация так называемых факторов транскрипции, то есть белков, связывающихся с регуляторными участками определенных генов в ДНК и активирующих транскрипцию данных генов. Иными словами, под действием факторов транскрипции на соответствующих генах происходит синтез матричных РНК, а на матрице последних - белков. Это те белки, которые нужны для роста и размножения клеток. И снова среди генов, кодирующих факторы транскрипции, оказываются онкогены. Если соответствующий ген работает с высокой активностью независимо от описанной выше регуляторной цепи, то он способствует превращению нормальной клетки в опухолевую (см. рис. 1).

Итак, многие гены, кодирующие белки передачи сигнала для роста и размножения клеток, являются потенциальными онкогенами. В отлаженной системе нормальной клетки они обеспечивают строго регулируемые рост и размножение, но при повреждении или нерегулируемой активации этих генов клетки превращаются в раковые.

Превращению нормальной клетки в опухолевую противостоят другие системы. Одна из них - это цепь передачи сигнала для подавления клеточного роста от поверхности клетки к ядру. Эти цепи состоят из компонентов, подобных описанным выше, но имеющих противоположный знак действия, то есть их действие реализуется в подавлении транскрипции генов, необходимых для роста и размножения клеток. Некоторые гены, продукты которых участвуют в таком процессе, были идентифицированы как ГСО, их инактивация индуцировала преобразование клеток в опухолевые.

Важный механизм, препятствующий превращению нормальной клетки в опухолевую, - это механизм "проверки в ходе клеточного цикла"(рис. 2). Размножаясь, клетки проходят через несколько фаз клеточного цикла. Важнейшие фазы - это деление клеток или митоз (М); фаза, предшествующая синтезу ДНК (G1); фаза репликации или синтеза ДНК (S), когда происходит удвоение генетического материала; следующая за ней фаза подготовки к делению (G2) и снова митоз (M). Кроме того, клетки могут переходить из G1 не в S, а в фазу G0 или фазу покоя, когда деление клеток отсутствует.

Оказалось, что переход из одной фазы клеточного цикла в другую - это строго регулируемый процесс. На определенных этапах клеточного цикла существуют "точки проверки", во время которых специальные белки определяют, все ли в клетке в порядке и готова ли она к переходу в следующую фазу цикла. Например, если в клетке повреждена ДНК, об этом идет сигнал и переход в следующую фазу блокируется. Или, например, в клетке синтезируются не те белки, которые должны синтезироваться на данном этапе. Опять идет сигнал о блокаде перехода в следующую фазу. Очень важной точкой проверки является точка между G1 и S, поскольку именно в фазе S происходит удвоение генетического материала ДНК и становится возможным последующее деление клетки.

Ясно, что такая система проверки требует большого количества специальных белков. Ключевая роль в разрешении на продвижение по циклу принадлежит белкам семейства циклинов. Последние связываются со специальными ферментами, фосфорилирующими белки, циклинзависимыми киназами (ЦЗК). Только находясь в комплексе с циклинами, ЦЗК начинают фосфорилировать свои белки-мишени, и это, в свою очередь, активирует гены, продукты которых нужны на следующей фазе цикла.

Многие гены, кодирующие белки - участники этой системы контроля, выступают в роли онкогенов или ГСО. Гены, кодирующие белки, помогающие клетке беспрепятственно пройти через цикл, выступают в роли онкогенов. Гены, кодирующие белки, которые блокируют прохождение клетки через точки проверки, выступают в роли ГСО. Как бы то ни было, недостаточно только запустить сигнализацию о необходимости роста и размножения клеток, надо еще сломать системы проверки.

Что же происходит с клеткой, которая остановилась в своем движении по клеточному циклу в точке проверки, например из-за того, что в ней оказалась повреждена ДНК. Первый путь - это устранение повреждений ДНК с помощью специальных ферментов. Если такая "репарация ДНК" не произойдет, то остановленная в своем продвижении по циклу клетка вступает на путь "программированной смерти", которая обозначается термином "апоптоз". Приходят в действие специальные клеточные системы, которые разрушают ее жизненно важные структуры, в том числе хромосомы, и клетка умирает. Апоптоз играет большую роль в развитии организма, ибо таким путем устраняются ненужные организму клетки. Таким же способом устраняются клетки, которые получили повреждения и резко изменили свои свойства, - различные мутантные клетки. Именно эти механизмы устраняют многие клетки, приобретшие черты раковых. Они сами себя убивают.

Как и другие перечисленные процессы, апоптоз определяется большим числом белков. Одно из центральных мест занимает ген, кодирующий белок р53, - белок с молекулярным весом около 53 000. Этот белок включает апоптоз не только если в ДНК появляются повреждения, но и во многих других случаях. Наряду с белками, включающими апоптоз, есть белки, препятствующие апоптозу, и между теми и другими существует тонкий баланс. Апоптоз выступает в роли мощного защитника от превращения нормальной клетки в раковую. Гены, способствующие апоптозу, относятся к ГСО, а гены, ему препятствующие - к онкогенам.

Поломка процесса апоптоза резко облегчает клетке превращение в раковую. В неспособных к апоптозу клетках легко будут накапливаться различные повреждения ДНК, ведущие к появлению мутаций. Среди этих мутаций будут встречаться мутации, активирующие онкогены и подавляющие ГСО. Клетки с такими мутациями приобретут преимущества в отношении роста и размножения перед своими собратьями и начнут разрастаться.

На их пути к окончательному приобретению независимости и превращению в раковые клетки стоит еще одна преграда - ограничение числа клеточных делений в нормальных клетках в связи с укорочением концов хромосом или теломеров. На концах хромосом расположены особым образом устроенные отрезки ДНК или теломеры. При каждом делении длина теломера уменьшается. Когда их длина падает до критической величины, начинаются слипание концов хромосом, дезорганизация генома и гибель клеток. Поэтому если посеять на чашках клетки человека, то они примерно через 50 делений погибают - иными словами, в культуре клеток существует предел для размножения клеток, зависящий от утраты теломеров. Нормальные клетки человека и других животных в культуре смертны. Однако у человека и других видов есть клетки, функцией которых является размножение и поддержание нужного уровня числа клеток в организме. У этих клеток потеря теломеров не происходит благодаря тому, что в них есть фермент теломераза, восстанавливающий исходные размеры теломеров. В более зрелых клетках, из которых обычно происходят опухолевые клетки, теломераза утрачивается, ген для нее сохраняется, но он молчит.

Большинство опухолевых клеток в культуре клеток не погибает, а продолжает расти в течение бесконечно длительного времени, пока им предоставляется свежая среда. Они становятся бессмертными. Одновременно эти клетки содержат активный фермент теломеразу, то есть в них ген теломеразы работает. Следовательно, ген теломеразы выступает в роли еще одного онкогена, позволяющего опухолевым клеткам благодаря его активации приобретать бессмертие. Следует отметить, что в некоторых опухолевых клетках существуют и другие механизмы приобретения бессмертия.

Это основные, хотя и не все классы онкогенов и ГСО, участвующие в превращении нормальной клетки в опухолевую. Кроме перечисленных генов и их белковых продуктов, для которых установлена функция, открыто еще много онкогенов, и особенно ГСО, для которых функция еще не установлена. Поэтому можно ожидать появления новых функциональных групп среди ГСО и онкогенов. Как бы то ни было, видно, что громадное число генов, тем или иным способом связанных с контролем роста и размножения клеток, при своих изменениях (мутациях) могут способствовать превращению нормальной клетки в опухолевую.

Важным открытием явилось установление факта, что, как правило, активации одного онкогена или, наоборот, потери функции одного ГСО недостаточно для превращения нормальной клетки в опухолевую. Это понятно в свете приведенных данных о наличии разных барьеров, стоящих на пути такого превращения. В среднем подсчитано, что в случае клеток человека число таких мутационных событий составляет в среднем 10. Только при этом нормальная клетка становится раковой. У мышей, на которых ведется большинство экспериментов по индукции опухолей, этот барьер снижен - там необходимо 3-5 мутационных событий.

Поскольку онкогенов и ГСО чрезвычайно много, то и набор мутаций в различных опухолях человека весьма разнообразен. В одних опухолях активированы или подавлены одни гены, в других - другие. Каждая опухоль, таким образом, имеет свой генетический портрет, который и определяет ее свойства. Более того, опухоль часто гетерогенна, то есть в ней есть клетки с разным набором генетических изменений.

Это создает крайне сложную и запутанную картину, когда речь заходит об анализе механизма возникновения какой-либо конкретной опухоли человека. Особенно важно, что это многоообразие и гетерогенность сильно ограничивают возможности разработки терапии опухолей на основе знания произошедших в ней генетических изменений. Ситуация несколько облегчается тем, что некоторые ГСО или онкогены оказываются измененными гораздо чаще, чем другие. Так, например, ГСО, кодирующий белок р53, поврежден примерно в 50% всех опухолей человека, а онкоген ras содержит активирующую его мутацию примерно в четверти всех опухолей человека. Некоторые другие ГСО и онкогены изменены преимущественно в опухолях той или иной локализации.

Как отмечено выше, р53 играет важную роль в направлении клеток с поврежденной ДНК по пути апоптоза. Когда ген р53 выведен из строя, клетки с поврежденной ДНК (мутантные клетки) перестают выбраковываться и в них происходит накопление новых мутаций, которые могут затрагивать ГСО и онкогены. Поэтому повреждение р53 резко ускоряет аккумуляцию других изменений и дефект р53 наблюдается в опухолях очень часто.

В заключение остановимся на роли наследственной, вирусной и экологической компонент в развитии опухолей человека. Как правило, рак развивается у людей пожилого и старого возраста. Это связано с тем, что мутации в генах возникают случайно и вероятность накопления в клетке нужного для онкогенного превращения набора мутаций весьма низка - для этого требуются многие годы. Не последнюю роль играет и ослабление с возрастом иммунных систем организма, которые препятствуют выживанию опухолевых клеток.

Однако в некоторых случаях, обычно в определенных семьях, опухоли развиваются у людей более молодого возраста. Оказалось, что в этих случаях уже исходно во всех клетках организма в одном из онкогенов или ГСО имеется мутация. Тогда на ее фоне дальнейшее накопление мутаций, необходимых для превращения нормальной клетки в раковую, происходит быстрее и опухоли развиваются с гораздо большей частотой и в более раннем возрасте. Некоторые из таких мутаций предопределяют раннее развитие опухолей практически со 100%-ной вероятностью. Например, если у человека исходно поврежден ГСО rb, играющий важную роль в процессе контроля прохождения клетки через клеточный цикл, у него всегда развиваются опухоли сетчатки (ретинобластомы). Подобные наследуемые повреждения изучают, значительная часть их известна, а другие будут выявлены в ближайшие годы. Тогда с помощью предродовой генной диагностики с последующим абортом (в случае передачи плоду поврежденного гена) наиболее вредные мутации можно будет полностью вывести из человеческой популяции.

Другой часто обсуждаемый фактор - эпидемиологический. Поскольку опухоль - генетическая болезнь, она незаразна. Но, как отмечалось выше, имеются вирусы - носители онкогенов. ДНК таких вирусов, или их генетический аппарат, может встраиваться в геном клетки, где развивается вирус и таким образом в этих клетках появится активный онкоген. Например, вирус папилломы человека, передаваемый половым путем, вносит в геном клетки хозяина ген, белковый продукт которого связывается с белком р53 и его инактивирует. Результат тот же, что и при повреждении гена р53, опухоль непосредственно не возникает, но вероятность ее появления резко возрастает. Таким образом, некоторые вирусы, привнося в клетки новые онкогены, могут повышать вероятность возникновения рака у данного индивидуума.

Что касается роли негативных факторов внешней среды, ее загрязнение различными химикатами, то здесь ситуация тоже ясная. Большинство этих загрязнений обладает мутагенной активностью, то есть в их присутствии возрастают число мутаций в клетках организма и вероятность появления того набора мутаций, который приведет к онкогенному перерождению клеток. Естественно, что полностью от мутагенов избавиться нельзя: к ним относятся и солнечная иррадиация, и космические излучения. Но при хорошем контроле за уровнем загрязнения внешней среды вероятность повышения частоты мутаций естественно снижается.

Такова в настоящее время общая картина механизма превращения нормальной клетки в опухолевую. Основные принципы понятны, участники процесса раскрыты, но конкретные механизмы развития каждой отдельной опухоли различны, и полную картину этих изменений сегодня дать невозможно, а возможно, в этом и нет необходимости. Однако проблема рака остается нерешенной и требует новых и новых усилий. Хотя полученная информация позволяет уже сейчас предупреждать развитие некоторых видов опухолей, эта информация недостаточна для развития методов эффективной терапии.

1. Lewin B. Genes for SMA: Multum in Parvo // Cell. 1995. Vol. 80(1). P. 1-5.

2. Lewin B. The Best of Molecular Biology // Mol. Cell. 1997. Vol. 1(1). P. 1.

3. Lewin B. The Mystique of Epigenetics // Cell. 1998. Vol. 93(3). P. 301-303.

Георгий Павлович Георгиев, доктор биологических наук, профессор, действительный член РАН, директор Института биологии гена РАН, лауреат Ленинской премии, Государственных премий СССР и РФ, член пяти зарубежных академий. Область научных интересов - молекулярная генетика высших организмов. Автор одной монографии и 400 научных работ.

Клетки с раковыми мутациями могли бы использовать своё преимущество в скорости деления и захватить всю ткань, но им мешают другие клетки с такими же амбициями.

Злокачественные опухоли возникают из-за мутаций, которые разрешают клеткам бесконтрольно делиться. Эти мутации появляются как из-за внешних факторов, вроде канцерогенных веществ, которые мы съедаем и вдыхаем, так и по естественным внутренним причинам. Наши клетки регулярно обновляются, на место старых приходят новые, а новые берутся из стволовых клеток-предшественников, которые очень долго сохраняют способность делиться. Но при делении молекулярные машины, которые удваивают ДНК, неизбежно допускают ошибки, которые остаются неисправленными и постепенно накапливаются. Некоторые исследователи полагают, что раковые мутации возникают по большей части как раз из-за неточного копирования ДНК.

Некоторые мутации появляются у нас уже в юности (как в матке, например), а с возрастом их число возрастает десятикратно. Однако далеко не всегда они приводят к чему-то плохому. Исследователи из Института Сенгера полагают, что раковые мутации остаются безопасными из-за конкуренции между клетками-мутантами.

Мутация в стволовой клетке может попасть (и часто попадает) в онкоген – то есть в ген, который, например, управляет делением клетки, но который в норме сохраняет связь с реальностью, то есть воспринимает ограничительные сигналы из внешней среды, от других клеток, от других генов той же самой клетки и т. д. Но после мутации такой ген становится уже чуть менее управляемым, и теперь стволовая клетка-предшественник начинает делиться чуть быстрее, чем обычная стволовая клетка. С одной мутации рак не начнётся, но если клетка-мутант наплодит много потомков, то повышается вероятность того, что в них к этой первой мутации добавятся ещё пара-тройка, и клетки начнут делиться по-раковому.

Но клетки существуют в ткани не сами по себе, а в окружении множества других клеток. И в них тоже могут появляться мутации, которые ускоряют их деление, делая его чуть менее контролируемым. И если одни мутанты столкнуться с другими, у которых есть те же конкурентные преимущества, они начнут друг другу мешать, и в результате никто не будет делиться быстрее и никакой опухоли не появится. В наших тканях места мало, поэтому клеткам приходится согласовывать свои интересы друг с другом.

Исследователи проверили эту гипотезу в экспериментах с мышами, у которых специально заставляли мутировать эпителиальные клетки пищевода (пищевод и кожа – два органа, в которых к среднему возрасту большинство клеток уже несут в себе те или иные мутации). У мышиных клеток очень тщательно выискивали мутации и сопоставляли эти мутации с тем, насколько успешно клетки-мутанты одного рода занимают территорию и как их успех соотносится с соседями. В статье в Nature Genetics говорится, что клоны мутантов действительно сдерживали друг друга, так что в итоге все клетки делились с нормальной скоростью. Разумеется, если в каких-то клетках появятся мутации, которые сразу дадут сильное преимущество, то сбалансировать их другим клеткам уже не получится, и, скорее всего, начнёт развиваться опухоль.

Как именно клетки-мутанты сдерживают друг друга, авторы работы пока не знают. Но если мы поймём, какие сигналы они друг другу посылают, какие молекулы задействуют, то и сами мы сможем использовать эти же сигналы, чтобы подавлять рост уже настоящих раковых клеток.

Генетическая природа

За более чем 100 лет было доказано, что повреждение генов вызывает перерождение (трансформацию) нормальных клеток человеческого организма в злокачественные, определено, какие именно гены участвуют в этом процессе, открыты наследственные формы рака. Поочередное присоединение мутаций, приводящих к злокачественному перерождению клетки, называют канцерогенезом. И ключевым моментом для новых методов профилактики и терапии онкозаболеваний является именно раскрытие этих механизмов. На сегодняшний день специалисты в области онкологии рассматривают рак как болезнь, вызванную нарушениями в генетическом аппарате клетки, из-за которых она приобретает ряд способностей, приводящих к злокачественной трансформации.

Из-за большого количества происходящих подряд делений опухолевой клетке нужно большое количество энергетических ресурсов и строительных материалов. Ускоренный обмен веществ — это четвертая способность опухолевых клеток. При этом для получения необходимых ей веществ, опухолевая клетка начинает выделять в пространство вокруг себя молекулы, способствующие росту сосудов вокруг опухоли.

Кроме этого, бесконечное деление не дает клетке развиваться и проходить специализацию (функции клетки — прим.ред.). Она оказывается неспособной выполнять какую-либо функцию и поддерживать контакты с другими клетками, из-за чего приобретает способность к инвазии (проникновению вглубь — прим.ред.) и метастазированию.

Своевременное определение

В процесс канцерогенеза вовлечены два класса генов: протоонкогены, мутации в которых превращают их в онкогены, и гены-супрессоры, подавляющие рост опухолевых клеток. В настоящее время известно более 100 онкогенов и онко-супрессоров. Мутации в них могут не только возникать в отдельной клетке организма, но и наследоваться. В этом случае мы говорим о наличии у пациента наследственной предрасположенности к развитию той или иной опухоли. Выявлять таких людей крайне важно. С учетом их генетических особенностей и высоких рисков заболеть раком пока еще здоровым людям можно предложить специальную программу профилактики и наблюдения, которая позволит снизить риски развития злокачественных новообразований или выявить их на ранних стадиях, когда лечение максимально эффективно.

Если у человека уже выявлена опухоль, то, во-первых, необходимо проводить лечение с учетом наследственной природы заболевания, во-вторых, рассчитать риск развития других опухолей. Унаследованная мутация затрагивает все клетки организма человека, а это значит, что опухоль может возникнуть не только в одном органе. Кроме того, человек рискует передать мутацию, унаследованную от родителей, своим детям.

16 октября 2015

• 3940
• 3,2
• 2
• 4

• 
  Анна Петренко

• Биотехнологии
• Онкология
• Стволовые клетки

Клетки многоклеточного организма существуют не сами по себе, а в создаваемом ими самими тканевом окружении, подобно людям, являющимся элементами общества. Клеточная микросреда не только играет важнейшую роль в поддержании функционирования клетки, но и сама активно на него влияет. Реципрокные динамические взаимодействия между клеткой и ее окружением играют решающую роль в развитии онкологических заболеваний, ставших бичом нашего времени. Развитие современных технологий лабораторного изучения клеток и их микроокружения позволяет отследить эти процессы в беспрецедентных деталях и даже смоделировать в лаборатории микросреду по своему желанию.

Жизнь на Земле начиналась с простейших организмов, состоящих из одной клетки, которой приходилось быть самостоятельной и самодостаточной. Однако со временем начали появляться и более сложные существа. Клетки в них уже различались внешне и отвечали за разные функции организма, хотя всё еще могли быть не разнесены в пространстве. Что же касается современных многоклеточных организмов — тут уже не скроешь высокую сложность их устройства и сотни типов клеток, образующих ткани, складывающие всё тело: от носа до кончика хвоста. И здесь клетки должны работать особенно слаженно.

Специализированную физиологическую микросреду, в которой находится СК, называют тканевой нишей. Она поддерживает основные характеристики, отличающие стволовую клетку от всех остальных: плюрипотентность и способность самообновляться [1]. Начнет ли клетка делиться либо останется в покоящемся состоянии, тоже во многом зависит от среды вокруг нее [2, 3].

Более того, раковые клетки (РК), выделяя сигнальные молекулы, подготавливают специальные ниши для будущих метастазов. В этой связи крайне перспективной становится возможность манипулировать раковыми стволовыми клетками, влияя не на них самих, а на их микросреду или на окружение метастазов. Некоторые исследователи утверждают, что будущее противоопухолевой терапии — это разработка препаратов, направленных на РСК и метастатические ниши.

Структура микроокружения

Рисунок 3. Регуляция ниши стволовых клеток нормального кишечного эпителия и колоректального рака. Слева — Сигнальные молекулы, секретируемые кишечными субэпителиальными миофибробластами (ISEMFs) и клетками Панета (Paneth), способствуют обновлению пула СК и нормальной кишечной пролиферации. Справа — Состав микроокружения способствует размножению клеток колоректального рака (КРР) либо их переходу в состояние покоя, из которого они — под влиянием того же микроокружения — могут выйти и восстановить свой онкогенный потенциал. Рисунок из [17], адаптирован.

Роль воспалительных реакций

Микроокружение опухоли характеризуется постоянным воспалением. М2-макрофаги, нейтрофилы, тучные клетки, повышенная концентрация медиатора воспаления оксида азота (NO), многие провоспалительные цитокины — всё это способствует процветанию РК и увеличению агрессивности рака [19]. Поддерживают развитие опухоли также регуляторные Т-клетки и Т-хелперы 2 типа.

Среди сложнейшей сети сигнальных путей особое место по отношению к раку отводится двум системам, приводящим к активации генов, — NF?B и STAT3. Эти факторы транскрипции могут начать работу в ответ на многое: воспаление, бактериальные или вирусные антигены, стресс, свободные радикалы. Используя эти пути, опухоль образуется, пролиферирует, активирует процессы ангиогенеза и инвазии, метастазирует — в общем, делает практически всё для собственного развития. Как оказалось, активация NF?B задействована даже в формировании резистентности рака к химиотерапии и облучению. Эти виды лечения эффективно убивают дочерние раковые клетки, но редко уничтожают сами РСК [19], что обычно имеет печальные последствия в форме обострения болезни спустя какое-то время.

Однако иммунное микроокружение опухоли может оказывать и обратное влияние. Тогда в него включены другие клетки: M1-макрофаги, Т-хелперы 1 типа, цитотоксические Т-клетки, АПК и естественные киллеры [20]. Переключение с антиопухолевого режима на проопухолевый сейчас активно изучается. К примеру, недавно показано, как рак подавляет нормальные функции эффекторных Т-клеток [21].

Внеклеточный матрикс

Внеклеточный матрикс — это каркас микроокружения, формирующий его механическую структуру*. Его создают мезенхимальные клетки: фибробласты, хондроциты, остеобласты. Состав внеклеточного матрикса очень сложен и многообразен: в него входят коллагены — основные белки соединительной ткани (например, коллаген типа IV), протеогликаны, гликопротеины (фибронектин и ламинин-1) и другие компоненты. Ключевые ферменты матрикса — матриксные металлопротеиназы (ММП), разрушающие практически любой белок внеклеточного пространства и тем самым преобразующие его структуру. Двунаправленное влияние ВКМ и РК при некоторых условиях может способствовать прогрессированию опухоли, влиять на ее агрессивность и способность расселяться по всему организму [20]. Например, не только опухолевая клетка для своего роста ремоделирует матрикс, выделяя ММП, но их могут выделять и стромальные клетки микроокружения, облегчая инвазию РК.

Метастазирование и метастатические ниши

Модели изучения микроокружения

Сегодня существует множество моделей изучения того, как микросреда изменяет отдельные клетки и их ДНК, и сопутствующее оборудование становится всё более компактным, автоматизированным и многофункциональным.

Раньше для выращивания клеток в культуре преимущественно использовались двухмерные (плоские) матрицы. На них было показано, что ограничением формы или подвижности клетки можно спровоцировать деление, апоптоз или даже дифференцировку мезенхимальных СК человека. Сейчас к этим моделям добавились и трехмерные модели из синтетических гидрогелей и матриц, основанных на коллагеновых волокнах. С их помощью удалось обнаружить, что у клеток, культивируемых в 2D- или 3D-окружении, различаются* фенотип, клеточно-матриксная адгезия и даже экспрессия генов.

* — О том, как чипы различных размеров и разной архитектурной сложности направляют дифференцировку мышиных нейрональных клеток-предшественниц в нейроны либо глию, можно прочитать в статье [24].

Для более корректного сравнения клеток, выращенных в двух- и трехмерной среде, разработаны специальные микролунки: одиночная клетка контактирует с плоской поверхностью, на которую нанесены адгезивные лиганды. Так, изменяя упругость подложки, можно манипулировать формой клетки в пространстве [25].

На похожей модели другая группа исследователей показала, что фармакологическое ингибирование сигналинга киназ определенного семейства не дает спящим клеткам рака груди вновь начать делиться. Поскольку для пролиферации нужна также активация другого гена, то параллельная терапия двумя ингибиторами вызывает апоптоз и задерживает рост метастазов. Авторы указывают, что такое комбинированное лечение может предотвратить повторное развитие рака молочной железы [27].

Комбинированная система Polaris от Fluidigm Corp.

Микрофлюидика на службе исследователей клеточных ниш

Изучение единичных клеток с помощью биочипов на основе технологий микрофлюидики впервые было предложено в 2013 году, когда компания Fluidigm Corp. (США) анонсировала первый чип для профилирования гетерогенных популяций клеток [29]. Чип С1 TM позволил исследователю объединить захват отдельных клеток, лизис, обратную транскрипцию и амплификацию в единый автоматический протокол, тем самым решая большинство существующих проблем со скоростью эксперимента и надежностью и воспроизводимостью получаемых данных.

Довольно быстро биочипы заняли свою нишу во многих областях науки и медицины: изучении стволовых клеток, иммунологии, эпигенетике и, конечно, в онкологии. Так, с помощью биочипов была проведена одна из самых масштабных работ по определению клональности мутаций у пациентов с острым лимфобластным лейкозом. Результаты дали основания полагать, как именно происходило развитие заболевания в каждом конкретном случае [30].

В 2015 году Fluidigm Corp. анонсировала новую комбинированную систему Polaris TM , которая позволяла не только профилировать популяцию в целом, но и изучать влияние микроокружения на конкретные единичные клетки. На одном чипе теперь можно было выбрать клетки с интересующим иммунофенотипом, изолировать их в индивидуальных камерах и задать определенные параметры клеточной ниши.

Помимо манипуляций с потоками среды и газа, температурой и влажностью, в камеры клеток можно вводить дополнительные факторы, в том числе сигнальные молекулы, РНК, вирусы и бактерии. Такая свобода действий позволяет, во-первых, смоделировать практически любое клеточное состояние — апоптоз ли, пролиферацию, воспаление, гипоксию, дифференцировку или синтез специфических белков, а во-вторых, получать воспроизводимые и надежные результаты, гарантировать которые могут только приборы с высоким уровнем автоматизации. Более того, с того момента, как клетка попадает на чип, за каждым мгновением ее жизни ведется наблюдение, что позволяет напрямую соотносить изменения в микроокружении с фенотипом и экспрессией генов конкретной клетки.

Приборы типа Polaris TM открывают огромные перспективы в области изучения клеточного микроокружения, какую бы конечную цель не ставил перед собой исследователь — проверить эффективность нового лекарства, изучить новый сигнальный каскад или посмотреть, как меняется фенотип клетки в тех или иных условиях [31, 32].