Полиморфизмы генов и рак

В структуре онкологической заболеваемости в Якутии рак легкого занимает лидирующие позиции [2]. Острота проблемы обусловлена не только высокой распространенностью заболевания, но и поздней диагностикой [3; 4]. Кроме того, рак легкого характеризуется неудовлетворительными результатами лечения и, как следствие, высокой летальностью.

Рак легкого, как и многие онкологические болезни, является многофакторным заболеванием, в развитии которого важную роль играют как внешнесредовые, так и генетические факторы. Многие исследователи связывают развитие рака с мутациями (полиморфизмом) в генах, кодирующих ферменты биотрансформации ксенобиотиков [18].

Глутатион-S-трансферазы (GST) – большая группа ферментов, которая подразделяется на 4 класса: α, μ, π, θ; они вовлечены во вторую фазу биотрансформации эндогенных и экзогенных ксенобиотиков. Глутатион-S-трансферазы обладают широкой субстратной специфичностью, метаболизируя многие субстраты. Ферменты детоксикации имеют широкий изоферментный спектр, что определяется полиморфизмом кодирующих их генов. Различия в составе изоэнзимов приводят к разной способности метаболизма чужеродных веществ у различных людей, что может обуславливать неодинаковую степень предрасположенности к заболеваниям, развитие которых тесно связано с факторами внешней среды.

Полиморфизм в гене GSTM1, кодирующего фермент глутатион-S-трансферазу класса μ, характеризуется делецией по обеим аллелям, которая приводит к полному отсутствию синтеза белкового продукта, результатом чего является глубокое подавление функции фермента. По литературным сведениям имеются противоречивые данные относительно ассоциации ноль-генотипа GSTM1 с риском возникновения рака легкого. Так же, как в случае с GSTM1, обширная делеция в структурной части гена GSTT1 ассоциируется с низкой эффективностью детоксикации потенциальных канцерогенов, что может быть связано с широкой предрасположенностью к раку [1].

Целью настоящей работы являлось изучение полиморфных вариантов генов ферментов 2-ой фазы детоксикации ксенобиотиков – GSTT1 и GSTM1 у больных раком легкого.

Материалы и методы исследования

Молекулярно-генетические и клинико-биохимические исследования проведены у 36 человек якутской национальности больных раком легкого, поступивших в Якутский республиканский онкологический диспансер. Контрольная группа была подобрана с учетом возраста, этнической принадлежности и включала 65 человек. Основным критерием отбора в контрольную группу было отсутствие онкологических заболеваний.

Для выделения ДНК использовался стандартный метод фенольно-хлороформной экстракции [9]. Анализ полиморфных вариантов специфических участков генов GSTM1, GSTT1, CYP1A1 проводили с использованием метода полимеразной цепной реакции, используя структуру праймеров описанных ранее [8; 13; 21].

Биохимические показатели: активность аланин-аминотрансферазы (АЛТ), аспартат-аминотрансферазы (АСТ), γ-глутамилтрансферазы (γ-ГТ) определяли на биохимическом автоматическом анализаторе Cobas mira plus (La Roche Ltd).

Статистическую обработку полученных данных проводили с помощью пакета прикладных статистических программ SPSS for Windows 10.0. Применяли стандартные методы вариационной статистики: вычисление средних величин, стандартных ошибок, 95 % доверительного интервала. Достоверность различий между средними значениями оценивали с помощью критерия t Стьюдента для независимых выборок. Данные в таблицах представлены в виде M ± m, где M – средняя, m – ошибка средней. Вероятность справедливости нулевой гипотезы принимали при p Примечание. р – достигнутый уровень значимости для χ2 соответственно для сравнения выборок больных раком легкого со здоровыми.

В обследование больных раком легкого входило определение биохимических показателей (АЛТ, АСТ, ГГТ), позволяющих судить о функциональном состоянии печени. Активность учитываемых нами ферментов у больных раком легкого была выше по сравнению с контролем. Активность АЛТ в крови больных была больше в 1,2 раза (11,50 ± 0,51 МЕ), АСТ в 1,1 раза (26,27 ± 0,89 МЕ), а ГГТ в 1,5 раза (54,72 ± 2,01 МЕ) по сравнению с контрольной группой.

Анализ зависимости активности АЛТ, АСТ и γ-ГТ от комбинации генотипов GSTT1 и GSTM1 у пациентов выявил общую закономерность: носители комбинации GSTT1(+/+)/GSTM1(+/+) имели наиболее низкие значения этого показателя, у обладателей хотя бы одного мутантного гена (комбинации генотипов GSTT1(0/0)/GSTM1(+/+) или GSTT1(+/+)/GSTM1(0/0)) активность АЛТ была повышена, а у пациентов с наличием мутации в обоих генах (комбинация генотипов GSTT1(0/0)/GSTM1(0/0)) наблюдался самый высокий уровень активности ферментов (табл. 2).

Средние значения активности АЛТ, АСТ и γ-ГТ в сыворотке крови у пациентов с раком легкого с различными комбинациями генотипов GSTM1/GSTТ1

Эти гены действуют в качестве генов-супрессоров опухолевой трансформации клетки вследствие их роли в поддержании целостности генома. В норме эти гены обеспечивают синтез белков, которые подавляют образование опухоли путем ограничения роста клеток. Они также выступают в качестве регуляторов транскрипции и репарации ДНК. Мутации этих генов приводят к инактивации их функций и развитию опухолевого процесса.

Развитие рака молочной железы может быть спорадическим (около 85%), т.е. повреждения генов происходит после рождения под воздействием разных факторов, врожденные формы заболевания (около 15%) вызваны мутациями в генах, передающихся по наследству. В исследованиях выявлена четкая ассоциация наличия мутаций генов BRCA1,2 и развития рака молочных желез. Также обнаружена положительная корреляция с развитием рака яичников и мутаций в генах. Мутация в гене BRCA1 встречается в 75% случаев наследственных форм рака яичников, а в 25% в гене BRCA2.

По разным оценкам одна женщина из 800 является носительницей мутации в гене BRCA1Вероятность развития рака молочной железы или яичника у женщин, имеющих наследуемые мутации гена BRCA1, достигает более 80% в течение их жизни. При этом у них в возрасте до 50 лет заболеваемость данной онкопатологией оказывается в 8-10 раз выше, чем в общей популяции. Среди больных раком молочной железы с отягощенным семейным анамнезом (наличие рака молочной железы у близких родственников) генные мутации встречаютя очень часто. Наличие мутаций в генах BRCA1,2 в отягощенных РМЖ семьях обуславливает риск данной болезни на 80-90%.

Клиническое течение рака молочной железы у женщин с мутациями BRCA 1и 2 отличается от такового в популяции в целом. У таких больных чаще развивается высокодифференцированный рак с отсутствием рецепторов к эстрогенам. В целом же все эти факторы ассоциируются с большей склонностью к рецидиву и худшим прогнозом заболевания.

Кроме того, наблюдается высокая вероятность возникновения рака желудка, толстой кишки, эндометрия, поджелудочной железы, меланомы, мочевого пузыря, опухолей головы и шеи при патологическом BRCA1/2 генотипе.

Показания к анализу: новообразования в молочной железе, генетическая предрасположенность к раку молочных желез и яичников(наличие семейных форм рака молочных желез в анамнезе), планирование гормональной контрацепции.

Мутация 1,киназы конторльной точки клеточного циклаCHEK2 полиморфизм 1100delC.

Мутация 2киназы конторльной точки клеточного циклаCHEK2 полиморфизмIVS2+1G>A

Ген CHEK2 кодирует протеинкиназу, активирующуюся в ответ на повреждение молекулы ДНК. Данный опухолевый супрессор контролирует вход клетки в митоз (приводя к аресту клеточного цикла на стадии G1 или апопотозу.), репарацию ДНК. Впервые выявленные мутации CHEK2 были связаны с синдромом Li-Fraumeni (характеризующимся чрезвычайно инвазивным фенотипом семейного рака, обычно связанным с наследственными мутациями в гене р53). Кроме того, мутации в этом гене определяет предрасположенность к саркомам, раку молочной железы, и опухолям головного мозга.

Наследственная мутация 1100delC приводит к синтезу неполноценного укороченного белка CHEK2. Аллель 1100delC CHEK2 ассоциирован с 1.4–4.7 кратным увеличением риска возникновения рака груди у женщин, несущих эту мутацию. Частота аллеля 1100delC составляет 1.1–1.4% среди групп здорового контроля в европейской популяции. Данный аллель 1100delC вместе с BRCA1 5382insC вносит значительный вклад в развитие рака молочной железы в России. При наличии мутации 1100delC в отсутствие мутаций BRCA1,2 риск развития рака увеличивается в 2 раза. Частота данной мутации у лиц с семейными формами РМЖ, не имеющих мутаций в BRCA1,2 была выше, чем в популяции и в семьях с мутациями BRCA1,2.

Аллель IVS2+1G-A CHEK2 связывается с возникновением онкологии различной локализации; чаще всего встречается у больных с раком простаты и молочной железы. Частота встречаемости IVS2+1G-A меньше аллеля 1100delC и чаще встречается в Белоруссии.

Показания к анализу. Определение индивидуального риска развития рака молочной железы, сарком, опухолям головного мозга.

Мутации BRCA1 5382insC, BRCA1 6174 delA, CHEK2 1100delC и, вероятно, BRCA1 185delAG) и должны быть рекомендованы для обследования всех больных РМЖ. Детекция мутации CHEK2 IVS2+1G>A анализ может быть ограничен группами высокого риска.

Полиморфизмы N-ацетилтрансферазы 2 (NAT2) 4 полиморфизма:NAT2*6А- Arg197Gln, NAT2*5B-Lys268Arg, Gly286Glu(857 g-a) Leu161Leu(481 c-t)

Показания к анализу: рак простаты, мочевого пузыря, рак легких, эндометриоз, прием лекарств, метаболизирующихся с участием NAT2.

Мутация поли(АДФ-рибозил)полимеразыPARP1(ADPRT)Val762Ala T>C

Поли(АДФ-рибозил)полимеразы - группа ферментов, участвующих в репарации ДНК, катализируя поли(АДФ-рибозилирование) белков, связанных с ДНК. Эти ферменты активируются при повреждении ДНК.

Активность PARP возрастает в 500 раз и более при связывании с участками разрыва ДНК. Фермент PARP-1 вовлечен в процессы репликации, транскрипции и репарации. Известно несколько видов PARP, кодируемых разными генами. Наибольшее значение имеет PARP-1, так как она ответственна за синтез до 90% поли(ADP-рибозы) в клетке.

Показано, что окислительный стресс и апоптоз вносят немалый вклад в патогенез таких затолеваний как хронический гломерулонефрит, диабетическая полинейропатия, инсульт. И в ряде работ получены данные об ассоциации полиморфного маркера Val762Ala гена ADPRT1 с диабетической полинейропатией (ДПН) при сахарном диабете типа 1 (СД типа 1), хонического гламерулонефрита, инсульта при которых одним из патогенетических факторов развития является окислительный стресс и избыточное образование свободных радикалов оказывающих повреждающее действие на ДНК и мембранные структуры нейронов, и как следствие приводящих к гибели клеток и апоптозу.

Кроме того, были выявлены корреляции анализируемого полиморфизма гена PARP1 с объемом очага ишемического повреждения и с тяжестью состояния больных на разных сроках обследования. Упациентов с генотипом Т/Т на всех сроках обследования достоверно чаще встречались очаги инфаркта большого объема по сравнению с носителями С/С и Т/С генотипов. И среди носителей Т/Т генотипа преобладали пациенты с тяжелым течением инсульта, а у больных с генотипами С/С и Т/С наблюдалось заболевание средней степени тяжести.

Таким образом, полиморфизм гена PARP1 ассоциирован с развитием и прогрессированием инсульта у больных – С/С и Т/С генотипы являются вариантом более легкого течения заболевания, а Т/Т генотип связан с развитием тяжелого инсульта.

Показания к анализу: Риск ишемической болезни мозга ишемический инсульт, хронический гламерулонефрит, диабетическая полинейропатия.

МРТ молочных желез. Стрелочка указывает на опухоль

Nevit Dilmen, Wikimedia Commons

Генетики обнаружили 65 новых полиморфизмов в ДНК, ассоциированных с риском развития рака груди и еще десять, связанных с определенным его типом (эстроген-нечувствительным раком). Кроме того, большинство этих полиморфизмов удалось связать с изменением в регуляции активности конкретных генов, что расширило знания ученых о механизмах развития заболевания. Работы, опубликованные в Nature и Nature Genetics стали результатами нескольких масштабных международных проектов по исследованию генетики и механизмов развития рака груди.

Предрасположенность ко многим распространенным типам рака наследуется. Для рака груди количество семейных случаев насчитывает от пяти до десяти процентов от всех случаев развития болезни, однако близнецовые исследования показывают, что генетическая предрасположенность к развитию рака может объяснять до 40 процентов всех случаев. Самый высокий риск обусловлен мутациями в генах BRCA1 и BRCA2, которые кодируют компоненты системы репарации ДНК. К примеру, в 70-80 процентах случаев ER-негативный (эстроген-нечувствительный) рак молочной железы развивается у носительниц мутаций в гене BRCA1.

Для того чтобы вычислить риск развития заболевания, генетики занимаются поиском вариантов в ДНК (однонуклеотидных полиморфизмов), которые с большей вероятностью встречаются у женщин с диагностированным раком груди, чем у здоровых. В подавляющем большинстве случаев вклад единичного полиморфизма незначителен, однако на основе большого числа вариантов генетики определяют степень риска (risk score), которая количественно отражает предрасположенность к развитию заболевания.

До сих пор было известно около 120 полиморфизмов, ассоциированных с риском развития рака груди. Теперь, по итогам нескольких больших международных проектов ученые обнаружили еще 65 новых. Суммарно в опубликованном в Nature исследовании было задействовано более 120 тысяч женщин европейского происхождения и 14 тысяч азиатского с раком груди, а также 120 тысяч здоровых женщин.

Половина участниц была генотипирована при помощи теста OncoArray. В рамках этого проекта международная команда исследователей разработала тест для определения 570 тысяч однонуклеотидных полиморфизмов, включая редкие варианты и известные варианты, ассоциированные с различными видами рака. Образцы были собраны в результате 68 отдельных исследований, проведенных международным консорциумом по исследованию генетики и механизмов развития рака груди (BCAC). Данные для другой половины участниц были собраны в результате мета-анализа 12 крупных полногеномных исследований. Всего ученые проанализировали связь с заболеванием для 11,8 миллионов известных полиморфизмов.

По итогам исследования количество известных генетических вариантов, ассоциированных с риском развитием рака молочной железы, выросло до 180. Суммарно эти варианты вносят вклад в 18 процентов семейных случаев болезни, однако исследователи утверждают, что потенциал теста OncoArray не раскрыт до конца, и с его помощью можно обнаружить варианты для 40 процентов случаев. Большинство этих вариантов попадает в некодирующие области генома, то есть связано с регуляцией активности генов.

В опубликованном отдельно исследовании консорциум обнаружил десять новых полиморфизмов, ассоциированных с риском развития ER-негативного рака молочной железы у женщин европейского происхождения. Кроме того, ученые подтвердили десять ранее опубликованных полиморфизмов, связанных с этим типом рака. Данные были собраны также при помощи анализа OncoArray в ходе исследований BCAC и CIMBA (Consortium of Investigators of Modifiers of BRCA1/2) —консорциума по изучению вклада в развитие рака мутаций в генах BRCA. Большая часть мутаций, связанных с ER-негативным раком, при этом не была ассоциирована с ER-позитивным, что говорит о независимых механизмах возникновения двух типов заболевания. По словам исследователей, 20 найденных вариантов, вкупе с сотней обнаруженных ранее, объясняют 16 процентов наследственных случаев ER-негативного рака молочной железы.

Таблица с перечислением десяти полиморфизмов (SNP), ассоциированных с ER-негативным раком груди, с привязкой к конкретным генам

Определение генетических полиморфизмов гена BRCA, ассоциированных с риском развития рака молочной железы (8 точек)

Для определения степени риска возникновения у будущего поколения онкозаболеваний молочной железы используют специфическое исследование биологического материала на предмет наличия/отсутствия полиморфизмов маркеров BRCA. Мутации в этих генах ассоциируют с высокой вероятностью развития рака. Специалисты в режиме реального времени проводят цепную полимеразную реакцию. Анализ позволяет с высокой степенью детекции выявить и определить тип мутаций в конкретном гене.

Сроки выполнения	до 7 дней
Синонимы (rus)	Генетические полиморфизмы BRCA , онкотест BRCA
Cинонимы (eng)	BRCA (PCR), PCR BRCA1/2
Методы	ПЦР (полимеразная цепная реакция)
Подготовка к исследованию	Специальной подготовки для взятия материала на анализ не требуется.
Подготовка к исследованию	Сбор проб крови осуществляется исключительно в условиях лаборатории, клиники.
Тип биоматериала и способы его взятия	Цельная кровь (берется из вены)

Ученые определили, что рак яичников и молочных желез в 7-14% случаев является наследственным заболеванием, которое вызывают мутации (генетические полиморфизмы) в ряде генов (супрессоры) опухолевого роста. Маркерами заболевания считаются:

BRCA1 — патологии гена обуславливают возможность возникновения рака ассоциированного типа. Отличаются значительной степенью злокачественности, вероятностью развития прогестерон- и эстроген-отрицательных образований и рядом серьезных осложнений;
BRCA2 — полиморфизмы маркера обуславливают возникновение спорадического онкозаболевания.

Однако перечисленные гены не считаются исключительно специфическими для развития рака репродуктивных органов. Патологии в маркерах могут говорить о возможности развития у будущего поколения и иных онкозаболеваний: мочевого пузыря, толстой кишки, эндометрий, желчно-выводящих путей, меланомы и прочих. Оба гена отвечают (кодируют) за функциональную активность и синтез белка. Мутации обуславливают патологии процессов восстановления клеток — клеточный цикл не регулируется, что в 7 из 10 случаев становится причиной канцерогенеза. То есть естественная противоопухолевая защита (активность) белка резко падает (может быть полностью нарушеной).

Своевременное проведение исследований на предмет выявления генетических мутаций в маркерах-супрессорах BRCA1 и BRCA2 позволяет специалистам определить степень риска и характер онкозаболевания. А значит, вовремя принять меры по предупреждению развития (своевременному лечению) опухолевого образования.

В особую группу риска входят все женщина репродуктивного (25-55 лет) возраста, в чьем семейном анамнезе упоминаются онкологические заболевания рака молочной железы, яичников. Анализ рекомендуется проходить всем женщинам в первой линии родства. Помимо этого исследование назначается при:

Обнаружении атипичных пролиферативных недугов груди;
Диагностировании множественно-первичных образований в молочной железе, яичниках или иных органах;
Появлении онкообразования в раннем возрасте;
Первичном диагностировании у 1-2 родственников образований одинаковой локализации;
Обнаружении редких форм рака.

Также анализ на выявление патологий в маркерах BRCA1 и BRCA2 могут назначить курильщицам, женщинам, подвергшимся ионизирующему облучению, имеющим дефекты генов, злоупотребляющих алкоголем, страдающим бесплодием или невынашиванием плода.

Цепная полимеразная реакция либо обнаружит, либо не обнаружит полиморфизмы. Если мутации в генах-маркерах отсутствуют, риска нет. Если мутации выявлены, то это говорит о том, что риск возникновения онкоопухолей вероятен. Однако интерпретировать результат анализа может только врач-онколог, который по типу и виду мутаций (оба гена представляют собой длинные цепочки, патология может быть не одна) определит возможную локализацию образования и рассчитает вероятность его развития.

Предметы

Аннотация

Мы провели генотипирование шести генов метаболизма фолата для 11 полиморфизмов в 460 случаях острого лимфобластного лейкоза у детей (ОЛЛ) и у 552 этнически подобранных контролей. Ни один из полиморфизмов, кроме 66A> G (I22M) в гене 5-метилтетрагидрофолат-гомоцистеинметилтрансферазы редуктазы ( MTRR ), не оказывал какого-либо влияния на риск заболевания. Носители G-аллеля были связаны с незначительным снижением риска ОЛЛ (глобальный Р с учетом поправки на пол = 0, 03; с поправкой на множественное тестирование Р = 0, 25). Анализ четырех полиморфизмов в гене MTRR показал статистически значимые различия в распределении гаплотипов между случаями и контролями (глобальный P G и 524C> T полиморфизмов в гене MTRR (глобальный P = 0, 03). Наши результаты показывают, что, помимо слабой ассоциации В детстве ALL с полиморфизмом 66A> G, гаплотипы в гене MTRR могут, отчасти, учитывать популяционные различия в риске.

Вступление

Острые лимфобластные лейкозы (ОЛЛ) являются наиболее распространенными злокачественными новообразованиями, которые поражают детей во всем мире. 1 Известные факторы риска лейкемии у детей включают ионизирующее излучение, синдром Дауна и моногенные расстройства, такие как атаксия-телеангиэктазия. 2, 3, 4 Предполагается, что как нео-, так и постнатальное воздействие и инфекции связаны с риском заболевания. 5 Повышенный риск у детей с ОЛЛ-пораженными близнецами в популяционном исследовании и высокая степень согласованности общего В-клеточного предшественника ОЛЛ среди монозиготных близнецов свидетельствуют о пренатальном происхождении заболевания. 6, 7 Этиология ALL поддерживает аргумент в пользу комбинаторных воздействий воздействий, наследственной восприимчивости и других влияний. 8

Унаследованная восприимчивость может потенциально модулировать ВСЕ риски от начала до полного проявления болезни. Обычные или редкие генетические полиморфизмы и сопровождающие гаплотипы в критических генах являются предполагаемыми модуляторами-кандидатами на ВСЕ восприимчивости. Более ранние исследования показали изменения риска из-за полиморфизмов в генах, кодирующих различные метаболические ферменты. 9, 10, 11, 12 В нескольких исследованиях различные аллели гена метилентетрагидрофолатредуктазы ( MTHFR ) были связаны с измененным риском острого лейкоза, тогда как в некоторых исследованиях такие эффекты не наблюдались. 13, 14, 15 Также были исследованы эффекты полиморфизмов в других генах метаболизма фолата на восприимчивость к лейкемии у детей. 14, 16

Ранее мы описали, что полиморфизмы MTHFR не влияют на восприимчивость ALL у детей в немецкой популяции. 17 Чтобы изучить роль полиморфизмов в других генах в метаболическом пути фолата в той же популяции, мы генотипировали 460 пациентов с ОЛЛ у детей и 552 этнически сопоставимых контрольных субъекта для 11 вариантов в шести генах, которые кодируют ферменты, участвующие в метаболическом пути фолата.

материалы и методы

Исследование населения

Исследуемая популяция состояла из 460 пациентов с детским заболеванием ALL (273 мужчин и 187 женщин) немецкого происхождения, завербованных в рамках продолжающегося терапевтического исследования (Берлин-Франкфурт-Мюнстер; BFM). 18 Пациенты случая родились между 1983 и 2003 годами со средним возрастом 6, 9 лет (± 4, 4 года). Пациенты, включенные в исследование, включали различные категории риска и морфологические подразделения (Таблица 1). Образцы крови от пациентов случая были взяты во время начального диагноза. Информированное согласие было получено от опекунов пациентов, и соответствующий совет по этическим нормам одобрил исследование. Контрольные субъекты включали 552 здоровых по этническому признаку здоровых человека немецкого происхождения, завербованных в 2004 году в Институте трансфузионной медицины и иммунологии, Мангейм (Германия). Контрольные субъекты родились на юго-западе Германии между 1959 и 1986 годами (Таблица 1). Хотя популяция Германии, вероятно, генетически однородна, мы использовали подход геномного контроля для оценки стратификации населения. 19 Все генотипированные полиморфизмы были использованы для оценки и сопоставления параметра стратификации ( λ ). Оценка параметра стратификации ( λ ) по методу геномного контроля составила 0, 47, что указывает на отсутствие признаков популяционной стратификации при 0, 05/11 (число исследованных полиморфизмов) = 0, 0045 доверительного уровня.

Таблица в натуральную величину

Гены и полиморфизмы

Полиморфизмы путем прямого секвенирования ДНК

Мы попытались проверить все полиморфизмы, выбранные из различных источников, путем секвенирования набора из 32 образцов ДНК. Для секвенирования ДНК фрагменты, содержащие варианты, амплифицировали с помощью ПЦР с использованием соответствующих праймеров (дополнительная таблица 2). Реакции секвенирования проводили с использованием набора для секвенирования циклов Big Dye Terminator (Applied Biosystems, Foster City, CA, USA), и данные анализировали, как описано ранее. 20

генотипирование

Однонуклеотидные полиморфизмы (SNP), подтвержденные секвенированием ДНК, были генотипированы 5'-нуклеазным методом аллельной дискриминации с использованием праймеров и флуоресцентно-меченных зондов (дополнительная таблица 3) и условиями, описанными ранее. 20

Повтор 5'UTR 28 п.н. и полиморфизмы делеции 3'UTR 6 п.н. в гене тимидилатсинтазы ( TYMS ) были генотипированы с помощью фрагментного анализа на генетическом анализаторе ABI Prism 3100 (Applied Biosystems). Фрагменты ПЦР амплифицировали, используя флуоресцентно-меченные прямые и немеченые обратные праймеры (дополнительная таблица 3). Продукты ПЦР подвергали электрофорезу, и анализ данных проводили с использованием программного обеспечения GeneScan analysis 3.7 (Applied Biosystems). Прямое секвенирование ДНК по меньшей мере 4% образцов подтвердило результаты аллельной дискриминации и анализа фрагментов. Образцы, которые не могли быть генотипированы после двухкратных повторных анализов и путем прямого секвенирования ДНК, использовались для расчета частоты неудач генотипирования.

статистический анализ

Соотношения шансов (ОШ) с поправкой на пол и соответствующие 95% доверительные интервалы (95% ДИ) для оценки ассоциации ОЛЛ с различными генотипами были рассчитаны с использованием SAS версии 9.1 (SAS Institute, Cary, NC, USA). Процедура гаплотипа SAS / Genetics Software использовалась для оценки частот гаплотипа в случаях и контролях отдельно, а также для вывода возможных комбинаций гаплотипов для каждого человека. Отношения между генотипом / гаплотипами и ВСЕМ риском были обобщены как глобальные P-значения , скорректированные для многократного тестирования методом перестановки Westfall и Young. 21 Связь между предполагаемыми комбинациями генотипов и восприимчивостью к ALL изучалась с использованием поэтапного подхода вперед; анализ начался с рассмотрения одного SNP, и были использованы тесты отношения правдоподобия, чтобы оценить, улучшило ли рассмотрение дальнейших генетических маркеров соответствие модели. 22 Нарушение равновесия сцепления рассчитывали с помощью программного обеспечения Haploview (www.broad.mit.edu/mpg/haploview/documentation.php). Расчеты мощности проводились с использованием программного обеспечения для расчета мощности и размера выборки версии 2.1.31.

Результаты

В экспериментах по валидации из 21 полиморфизма, идентифицированного из опубликованных отчетов и различных баз данных по восьми генам, участвующим в метаболическом пути фолата, только 12 полиморфизмов в семи генах были обнаружены в наборе из 32 тестовых образцов ДНК (дополнительная таблица 1). Подтвержденные полиморфизмы с небольшой частотой аллелей выше 0, 1 были генотипированы у детей, перенесших ALL, и в контрольной группе (таблица 2). Процент образцов (как случаев, так и контролей), которые не дали результатов в анализе генотипирования, варьировался от 1 до 7%. В подтверждающих экспериментах полное соответствие результатов наблюдалось между аллельной дискриминацией или методами анализа фрагментов генотипирования и секвенирования ДНК. Однако и анализ TaqMan для аллельной дискриминации, и методы секвенирования ДНК не позволили генотипировать полиморфизм 829C> T в 3'-UTR гена дигидрофолатредуктазы ( DHFR ) и поэтому были исключены из исследования. Распределение генотипов в контролях соответствовало равновесию Харди-Вайнберга для всех полиморфизмов, включенных в исследование. Размер выборки в нашем исследовании позволил выявить в рамках доминантной модели эффект полиморфизма с меньшей частотой аллеля, превышающей 0, 1, и ассоциированного ИЛИ, равного или меньшего, чем 0, 5, с мощностью более 80% (ошибка типа I 0, 05 / число исследованных полиморфизмов = 0, 0045).

Таблица в натуральную величину

За исключением 66A> G (I22M) в гене MTRR , статистически значимых различий между случаями и контролем по частоте аллеля и генотипа не наблюдалось ни для одного из полиморфизмов (таблица 2). Частота варианта G-аллеля для полиморфизма 66A> G в гене MTRR была ниже в контролях, чем в случаях (с поправкой на пол P = 0, 01, множественное тестирование с поправкой на P = 0, 15). Гетерозиготные и гомозиготные носители вариантного аллеля показали пониженный риск лейкемии (OR _{AG по сравнению с AA} 0, 7, 95% CI 0, 5–1, 0; OR _{GG по сравнению с AA} 0, 6, 95% CI 0, 4–0, 9; глобально скорректированный по полу глобальный P = 0, 03; множественный тестирование исправлено P = 0, 25). После коррекции для множественных сравнений различия в влиянии генотипов MTRR на риск более не были статистически значимыми. Генотип-специфические риски были однородными для разных категорий и морфологических подразделений заболевания (данные не представлены).

Анализ, включающий четыре полиморфизма 66A> G, 524C> T, 1049A> G и 1783C> T в гене MTRR , показал статистически значимое различие в распределении частот гаплотипа между случаями и контролем. Из 16 возможных гаплотипов 10 были обнаружены в контроле и шесть в случаях. Модулирующее влияние варианта аллеля на полиморфизм 66A> G на риск внутри гаплотипов показал двойственность в контексте аллеля при полиморфизме 524C> T. Гаплотипы GCAC и ATAC были связаны со сниженным риском ОЛЛ, в то время как гаплотипы ACAC и GTAC были связаны со значительно повышенным риском (Таблица 3, глобальный P = G и 1049A> G ( D ′ = 0, 95) и между 66A> G и 1783C> T (D ′ = 0, 83). Однако относительно слабая связь была обнаружена между 66A> G и смежным полиморфизмом 524C> T в гене MTRR (рисунок 1).

Таблица в натуральную величину

Неравновесная связь ( D ') между полиморфизмами в гене MTRR .

Изображение в полном размере

Различия в распределении гаплотипов между случаями и контролем мотивировали анализом комбинации генотипов (Таблица 4). За анализом отдельных SNP последовала стратификация генотипов 66A> G по второму SNP в гене MTRR . Наилучшая модель была обнаружена, когда случаи и контроли были классифицированы в соответствии с комбинациями генотипов, охватывающими полиморфизмы 66A> G и 524C> T ( P = 0, 03). Однако статистическое преимущество рассмотрения двух других SNP в гене по сравнению с моделью, где рассматривался только полиморфизм 66A> G, было небольшим ( P = 0, 05). Результаты указывают на защитный эффект аллеля MTRR 66G, в частности, в сочетании с соседним аллелем 524C. В целом, комбинация генотипов GG (66A> G) / CC (524C> T) была связана со сниженным риском (OR 0, 6, 95% CI 0, 3–0, 9), тогда как комбинация генотипов AA / CC была связана с повышенным риском (OR 1, 8 95% ДИ 1, 2–2, 8).

Таблица в натуральную величину

Комбинации генотипов среди исследованных полиморфизмов (в том числе в MTHFR из нашего более раннего исследования на той же популяции 17 ) показали равномерное распределение в случаях и контролях (данные не показаны). Гаплотипический анализ двух полиморфизмов в гене TYMS и двух SNP MTHFD1 не показал различий между случаями и контролем (данные не показаны). Значения неравновесного сцепления для двух полиморфных локусов TYMS ( D ′ = 0, 50) и двух локусов MTHFD1 ( D ′ = 0, 01) свидетельствуют об отсутствии сильной связи.

обсуждение

Метаболический путь фолата или одного углерода, который поддерживает соответствующий уровень фолата в клетках, включает множество ферментов. 14 Дисбаланс в метаболическом пути фолата был связан с различными расстройствами, включая рак. 23 В отличие от более ранних исследований небольшого размера, ни один из 11 полиморфизмов ни в одном из шести генов, исследованных в настоящем исследовании, за исключением полиморфизма 66A> G (I22M) в гене MTRR , не показал связи с ОЛЛ-восприимчивостью. 16 Интересно, что мы обнаружили, что гаплотипы, основанные на четырех SNPs в гене MTRR , включая предыдущие три неисследованных несинонимичных полиморфизма, 524C> T, 1049A> G и 1783C> T, показали значительное дифференциальное распределение в случаях и управления. Четыре гаплотипа, которые составляли почти 90% исследуемой популяции, были тесно связаны с модуляцией риска. Гаплотипы ACAC и GTAC были связаны с повышенным риском, тогда как GCAC и ATAC, по-видимому, были связаны с уменьшенным риском ALL.

Функционально MTRR поддерживает адекватные уровни метилкоба (III) аламина, функциональной кофакторной формы фермента метионинсинтазы (MS). 24, 25 MS в активной форме имеет важное значение для поддержания соответствующих уровней метионина, который действует как предшественник универсального донора метильной группы S -аденозилметионина. Мутации, в том числе делеции и вставки в гене MTRR , связаны с редким аутосомно-рецессивным расстройством типа cblE гомоцистинурии, приводящим к мегалобластной анемии и задержке развития в раннем детстве. 26, 27 Вариантный аллель для полиморфизма MTRR 66A> G ранее был связан с повышенным риском рака легких и пищевода и снижением риска плоскоклеточного рака головы и шеи. 28, 29, 30 Генотипические сочетания полиморфизмов в генах MTRR , MTHFR и MS были связаны с уменьшением риска развития ALL и неходжкинской лимфомы у взрослых. 24 В сочетании, полиморфизм 677C> T в гене MTHFR и полиморфизм MTRR 66A> G были связаны с повышенной концентрацией гомоцистеина в плазме. 31 Детство У всех пациентов с G-аллелем по полиморфизму чувствительность in vitro снижалась как в краткосрочных, так и в долгосрочных анализах метотрексата. 32 Было показано, что потребление фолиевой кислоты и других питательных веществ влияет на риск различных видов рака, включая лейкоз, связанный с полиморфизмом генов метаболического пути фолата. 14, 16 Однако в этом исследовании в отсутствие такой информации нельзя было оценить взаимодействие гена и питательного вещества, и нельзя исключать, что наблюдаемая здесь модуляция риска обусловлена взаимодействиями гена и фолата.

Возможность того, что наблюдаемые различия в риске лейкемии вследствие гаплотипов в гене MTRR отражают историческую связь с другими функциональными локусами или геном (ами), также нельзя исключать. Этот аргумент подтверждается предсказаниями таких ассоциаций и существованием больших гаплотипических блоков в геноме человека. 33 Кроме того, анализ комбинации генотипов не показал столь сильного влияния на модуляцию риска, как это наблюдалось с гаплотипами. Кроме того, изменение эффекта модуляции полиморфизма 66A> G (I22M) внутри гаплотипов на аллель при полиморфизме 524C> T, вероятно, указывает на дополнительный полиморфизм (ы) в гене MTRR , который вызывает дифференциальный риск рака либо напрямую, либо через взаимодействие с экологическим воздействием.

В заключение, в этом исследовании не было обнаружено связи между полиморфизмами в генах метаболизма фолата и детским ALL, за исключением варианта 66A> G в гене MTRR . Однако в качестве нового открытия мы сообщаем о значительной разнице в популяционном риске ОЛЛ у детей, связанном с гаплотипами, на основе четырех полиморфизмов в гене MTRR . Наше наблюдение четкого разграничения между риском и гаплотипами, не связанными с риском в гене MTRR , может частично объяснить дифференциальную восприимчивость к лейкозу у детей вследствие фоновой генетической композиции, которая, в сочетании с другими факторами, может приводить к расширению клонов с помощью химерные слитые гены, которые присутствуют примерно у 1% новорожденных, до явного детства ALL. 34

Читайте также: