Мутация янус-киназы 2 jak2 val617phe миелопролиферативные заболевания

стоимость указана без учета стоимости забора биологического материала

Добавить в корзину

Обычные: 8-12 р.д.

Дата сдачи анализа:
Дата готовности:

  • Бунинская аллея
  • Войковская
  • Дубровка
  • Марьино
  • Новокузнецкая
  • Подольск
  • Будни: 7.45-21.00
  • Выходные: 8.45-17.00

Подготовка не требуется.

  • Забор пробы на генетические полиморфизмы

Миелопролиферативные заболевания (МПЗ, хронические миелоидные опухоли) – группа заболеваний, характеризующихся избыточной пролиферацией одного или нескольких ростков кроветворения. Это группа Ph-негативных хронических лейкозов, обусловленных нарушениями на уровне гемопоэтических стволовых клеток. К самым распространенным заболеваниям этой группы относятся истинная полицитемия (эритремия), эссенциальная тромбоцитемия и первичный (идиопатический) миелофиброз. Частота встречаемости этих заболеваний составляет от 1 до 2,3 на 100 тыс. населения.

Истинная полицитемия характеризуется возрастанием количества циркулирующих эритроцитов (6–8 х 10 12 /л), в меньшей степени нейтрофилов и тромбоцитов, повышением гематокрита и спленомегалией (увеличение размеров селезенки).

Эссенциальная тромбоцитемия характеризуется увеличением количества тромбоцитов (> 450 x 10 9 /л), нарушением агрегационной способности тромбоцитов, развитием внутрисосудистого свертывания крови.

Первичный миелофиброз характеризуется фиброзом костного мозга, экстрамедуллярным гемопоэзом и спленомегалией.

В развитии хронических миелоидных опухолей выявлено более 20 соматических мутаций, из которых мутация JAK 2 Val617Phe в 14 экзоне локуса 9q24 гена янус-киназы 2 является наиболее распространенной. Она обнаруживается в 96% случаев у пациентов с истинной полицитемией, в 55% случаев при эссенциальной тромбоцитопении и примерно в 45-68% случаев при первичном миелофиброзе. Однако мутация может встречаться и при острой миелоидной лейкемии, миелодиспластическом синдроме, хронической миеломоноцитарной лейкемии. Мутация не передается по наследству. Частота встречаемости в мире составляет 4 на 10 тыс. человек.

Янус-киназа 2 (JAK 2) – это цитоплазматическая тирозинкиназа, которая является промежуточным звеном в JAK-STAT сигнальном пути, приводящему к активации генов посредством транскрипции. Замена в 1849-м положении G на T в гене янус киназы 2 приводит к замене валина (Val, V) на фенилаланин (Phe, F) в положении 617, итогом которой является изменение структуры белка и повышение его активности, приводя к активации пролиферации клетки и накоплению клеток зрелого миелоидного ряда.

Согласно ВОЗ (2015г.) наличие мутации является одним из диагностических критериев для постановки диагноза хронических миелоидных опухолей. Своевременное обнаружение мутации JAK 2 V617F позволяет назначить эффективную терапию для предотвращения развития миелопролиферативного заболевания и его осложнений.

Одним из основных осложнений таких заболеваний является тромбофилия, которая характеризуется предрасположенностью к тромбозам у пациента, и тем самым повышая риск антенатальной гибели плода во время беременности. Для исключения повышения риска тромбозов рекомендуется также провести обследование на наличие аутоиммунных антител (антифосфолипидный синдром) и генетические анализы на тромбофилию. Наличие МПЗ нередко служит фактором риска развития синдрома Бадда-Киари, поэтому для исключения гематологического заболевания назначают анализ на выявление мутации JAK 2 V617F. В некоторых исследованиях также отмечается связь данной мутации с уровнем липопротеинов высокой плотности, низкой плотности и общего холестерина. Однако корреляция еще не до конца изучена.

Анализ на выявление мутации JAK2 V617F имеет диагностическое значение и показан для:

  • установки и подтверждения диагноза истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитопении или первичного миелофиброза
  • дифференциальной диагностики миелопролиферативных заболеваний и вторичного эритроцитоза, реактивного тромбоцитоза и других форм МПЗ
  • дополнительный анализ к цитологическому и гистологическому исследованию костного мозга

Для экономии времени оформите заказ на анализ в Интернет-магазине! Оплачивая заказ онлайн, Вы получаете скидку 10% на весь оформленный заказ!

У Вас есть вопросы? Напишите нам или позвоните +7 (495) 514-00-11. По анализам Вы можете задать вопрос на нашем форуме и обратиться на консультацию к специалисту.

Материалы по теме






Скрининговые тесты и диагностика волчаночного антикоагулянта

— фермент, который синтезируется в печени. Играет важную роль в регуляции нормальной выработки гемопоэтических клеток. Изменение активности киназы обуславливает склонность к увеличению числа клеток одного или нескольких ростков кроветворения.
Выявление JAK2 V617F мутации в гене — генетический анализ, который позволяет определить риск развития миелопролиферативных заболеваний, полицитемии, риск прерывания беременности, образования тромбозов.

Синонимы

Определение JAK2 V617F мутации в гене; JAK2 полиморфизм, мутации гена JAK2 V617.

Метод исследования

Полимеразная цепная реакция в режиме реального времени ( ПЦР).

Биоматериал для анализа

Подготовка

Кровь желательно сдавать натощак.

Описание

Название гена: JAK2.

Мутации гена JAK2:

  • мутация гена JAK2 V617F,
  • определение наличия делеций в 12 экзоне гена JAK2 киназы,
  • мутации в гене , приводящие к заменам в 515 положении белка MPL.

Функция гена JAK2: кодирует регуляторные белки, обладающие тирозинкиназной активностью.

— это тирозинкиназа, фермент подкласса протеинкиназ, группы киназ. Синтезируется в печени. Тирозинкиназы ускоряют перенос фосфатного остатка от АТФ на тирозиновый остаток специфических клеточных . Регулируют клеточный рост и дифференцировку, апоптоз. Эти тирозинкиназы получили название наличия двух активных участков (доменов), сходных по строению, но противоположных по функциям.

Фермент служит промежуточным звеном между рецепторами на мембране клетки и сигнальными молекулами (например, факторы роста, пролактин, интерферон, интерлейкины). Когда определенные цитокины или факторы роста (эритропоэтин, тромбопоэтин, гранулоцитарный колониестимулирующий фактор и др.) связываются с рецепторами на поверхности клетки, активируются (фосфорилируются). Далее происходит последовательное активирование белков семейства STAT (Signal Transducers and Activators of Transcription). Белки STAT соединяются и проникают в ядро. Там они сами или с участием других белковых факторов передают сигналы о размножении, дифференцировки клеток гемопоэтического ряда (), тем самым влияя на кроветворную систему человека.

При появлении мутации JAK2 V617F происходит усиление сигнала от JAK2, что приводит к избыточному образованию клеток. При соматической мутации JAK2 V617F в позиции 617 валин заменен на фенилаланин. Появляется эта мутация в гемопоэтических . Фермент JAK2 всё время активирует белки сигнальных путей, которые воздействуют на образование и дифференцировку , что ведет к увеличению числа клеток одного или нескольких ростков кроветворения. Морфологически это проявляется в виде увеличения числа клеток костного мозга.

Для чего используется анализ

Анализ позволяет достоверно определить мутацию в гене JAK2.

Когда назначается

Установка или подтверждение диагноза истинной полицитемии, эссенциальной тромбоцитемии или идиопатического миелофиброза.

Определение риска развития тромбозов.

Определение риска прерывания беременности.

Исследование рекомендуется проводить в комплексе: цитогенетическое и гистологическое исследование костного мозга.

Референсные значения (норма)




    • На заглавную
    • О журнале

    Поиск

    Выявление мутации Jak2 V617F при хронических Ph-негативных заболеваниях

    А.М. САВРИЛОВА¹, А.В. КОСТЕРИНА², А.Р. АХМАДЕЕВ¹

    ¹Республиканская клиническая больница МЗ РТ, 420064, г. Казань, Оренбургский Тракт, д. 138

    ²Казанский государственный медицинский университет, 420012, г. Казань, ул. Бутлерова, д. 49

    Саврилова Алсу Мухарямовна — врач-гематолог консультативной поликлиники, тел. +7-905-312-63-09, e-mail: а[email protected] 1

    Костерина Анна Валентиновна — ассистент кафедры госпитальной терапии, тел. +7-917-273-77-68, e-mail: [email protected] 2

    Ахмадеев Арслан Радикович — заведующий отделением гематологии, тел. +7-927-240-55-90, e-mail: [email protected] 1

    Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) — это клональные заболевания, характеризующиеся избыточной пролиферацией (выработкой клеток) одного или нескольких ростков кроветворения. К частым миелопролиферативным заболеваниям относятся истинная полицитемия, (ИП), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ). Были выявлены специфические молекулярные аномалии, характерные для этих заболеваний. Наиболее часто встречаемая — мутация гена Янус-киназы 2 (Jak2 V617F).

    Ключевые слова: хронические миелопролиферативные заболевания, истинная полицитемия, эссенциальная тромбоцитемия, первичный миелофиброз, мутация Jak2 V617F.

    A.M. SAVRILOVA¹, A.V. KOSTERINA², A.R. AKHMADEYEV¹

    ¹Kazan State Medical University, 49 Butlerov St., Kazan, Russian Federation 420012

    ²Republic Clinical Hospital of the Ministry of Healthcare of the Republic of Tatarstan, 138 Orenburgskiy Trakt, Kazan, Russian Federation 420064

    Savrilova A.M. — doctor-hematologist of Consultative Outpatient Policlinic, tel. +7-905-312-63-09, e-mail: а[email protected] 1

    Kosterina A.V. — Assistant Lecturer of Hospital Therapy Department, tel. +7-917-273-77-68, e-mail: [email protected] 2

    Akhmadeyev A.R. — Head of Hematology Department, tel. +7-927-240-55-90,

    Chronic myeloproliferative diseases (CMPD) are clonal disorders with excess proliferation (cell production) of one or more lineages of hematopoiesis. The most common CMPDs are polycythemia vera, essential thrombocytosis and idiopathic primary myelofibrosis. Specific molecular abnormalities were found that are characteristic for these disorders. The most common of them is mutation of gene Janus kinase 2 (Jak2 V617F).

    Key words: chronic myeloproliferative diseases, polycythemia vera, essential thrombocytosis, idiopathic primary myelofibrosis, mutation Jak2 V617F.

    Хронические миелопролиферативные заболевания (ХМПЗ) — это заболевания, характеризующиеся избыточной пролиферацией (выработкой клеток) одного или нескольких ростков кроветворения, включающие несколько клональных Ph-негативных гематологических болезней. К частым миелопролиферативным заболеваниям относятся истинная полицитемия, (ИП), эссенциальная тромбоцитемия (ЭТ) и первичный миелофиброз (ПМФ) [1]. Их происхождение связано с трансформацией гемопоэтической стволовой клетки, результатом чего служит чрезмерная продукция зрелых клеток эритроидного, мегакариоцитарного и гранулоцитарного ростков с относительно продолжительным течением заболевания.

    Последние 5 лет ознаменовались фундаментальными успехами в понимании патогенеза этих болезней. Была выявлена специфическая для этих заболеваний молекулярная аномалия — приобретенная точечная мутация гена Янус-киназы 2 (Jak2 V617F), обнаруживаемая при ИП, ЭТ и ПМФ [2]. Данная мутация была открыта у большинства пациентов с ИП и у 50-60 % пациентов с ЭТ и ПМФ (табл. 1).

    Все члены семейства Янус-киназ (JAK1, JAK2, JAK3) и тирозинкиназа 2 (Tyk2) имеют активный киназный домен JH1 и сходный по строению домен JH2, осуществляющий функцию подавления активности киназы. Наличие двух сходных по строению, но противоположных по функции доменов в одной тирозинкиназе напоминает римского бога двуликого Януса, который смотрел одновременно в двух направлениях. Это послужило поводом для обозначения этих тирозинкиназ как Янус-киназ. Функция белков JAK заключается в том, что они служат промежуточным звеном между рецепторами на мембране клетки и сигнальными молекулами. Когда определенные цитокины или факторы роста (эритропоэтин (ЭПО), тромбопоэтин (TПO), гранулоцитарный колониестимулирующий фактор (Г-КСФ), интерферон-γ (ИФН-γ) и др.) связываются с рецепторами JAK-киназ на поверхности клетки, JAK-киназы активируются (фосфорилируются). Далее происходит последовательное фосфорилирование (активирование) белков семейства STAT (передатчик сигнала и активатор транскрипции). Активация путей JAK2 также приводит к активации сигнальных путей с участием митоген-активированного протеина (МАР-киназы), фосфатидилинозитол-3-киназы АКТ (PI3K-AKT), которые передают сигналы для выживания, пролиферации и дифференцировки эритробластных предшественников.

    При появлении мутации Jak2 (V617F или в экзоне 12) эти сигналы активируются автономно, независимо от связывания цитокина со своим рецептором [3, 4].

    Открытие мутации Jak2 V617F значительно улучшает наше понимание патогенеза ИП, ЭТ и ПМФ, но этиология ЭТ и ПМФ без мутации Jak2 V617F остается неясной. Известно, что большинство пациентов с ЭТ и ПМФ без мутации Jak2 V617F имеют, тем не менее, клональный гранулоцитопоэз.[5]

    Таблица 2.

    Диагностические критерии ВОЗ для ХМПЗ (2008)

    Hb или Ht >99% референтного значения по возрасту, полу или высоте проживания или

    Hb >170 г/л (муж.) или >150 г/л (жен.) при одновременном повышении уровня Hb на ≥20 г/л от исходного уровня без терапевтической коррекции дефицита железа или

    Повышенная масса эритроцитов ≥25% среднего нормального значения.

    Наиболее часто встречаемые осложнения ХМПЗ — это тромбозы, спленомегалия, гипоклеточность костного мозга и трансформация в острый лейкоз [10]. Тромбозы могут наблюдаться как за несколько лет до постановки диагноза, так и после него. Сорок процентов пациентов с портальными венозными тромбозами являются носителями мутации Jak2 V617F, поэтому этот диагностический тест необходим для этих состояний [11, 12] .

    Диагноз истинной полицитемии был установлен у 29 человек, первичного миелофиброза — 3 человека, эссенциальная тромбоцитемия — 5 человек.

    Из всех пациентов троим была проведена спленэктомия за несколько лет до установки диагноза вследствие развития тромбоза селезеночной вены.

    В настоящее время исследование на наличие мутации Jak2 V617F необходимое условие для установления правильного диагноза и определения дальнейшей тактики ведения пациента.

    1. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and of myeloproliferative neoplasms: Tye 2008 World Health Organization criteria and point-of care diagnostic algotryms // Leukemia. — 2008. — Vol. 22. — Р. 14-22.

    2. Kaushansky K. The chronic myeloproliferative disorders and mutation of JAK2: Dameshek’s 54 year old speculation comes of age // Best Pract. Res. Clin. Haematol. — 2007. — 20. — Р. 5-12.

    3. Saharinen P., Silvennoinen O. The pseudokinase domain is required for suppression of basal activity of Jak2 and Jak3 tyrosine kinases and for cytokine-inducible activation of signal transduction // J. Biol. Chem. — 2002. — 277. — Р. 47954-63.

    4. Feener E.P., Rosario F., Dunn S.L., Stancheva Z., Myers M.G. Jr. Tyrosine phosphorylation of Jak2 in the JH2 domain inhibits cytokine signaling // Mol. Cell Biol. — 2004. — 24. — Р. 4968-78.

    5. Pietra D., Li S., Brisci A. et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders // Blood. — 2007. — 111. — Р. 1686-9.

    6. Tefferi A., Gangat N., Wolanskyj A.P. et al. 20 yr without leukemic or fibrotic transformation in essential thrombocythemia or polycythemia vera: predictors at diagnosis // Eur. J. Haematol. — 2008. — 80. — Р. 386-90.

    7. Spivak J.L., Silver R.T. The revised World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocytosis, and primary myelofibrosis: an alternative proposal // Blood. — 2008. — 112. — Р. 231-9.

    8. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. et al. (eds.) WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues, 4th edn // Lyon: IARC-press, 2008.

    9. Tefferi A., Vardiman J.W. The diagnostic interface between histology and molecular tests in myeloproliferative disorders // Curr. Opin. Hematol. — 2007. — 14. — Р. 115-22.

    10. Harrison C.N., Green A.R. Essential thrombocythaemia // Best Pract. Res. Clin. Haematol. — 2006. — 19. — Р. 439-53.

    11. Kiladjian J.J., Cervantes F., Leebeek F.W. et al. The impact of JAK2 and MPL mutations on diagnosis and prognosis of splanchnic vein thrombosis: a report on 241 cases // Blood. — 2008. — 111. — Р. 4922-9.

    12. Primignani M., Barosi G., Bergamaschi G. et al. Role of the JAK2 mutation in the diagnosis of chronic myeloproliferative disorders in splanchnic vein thrombosis // Hepatology. — 2006. — 44. — Р. 1528-34.

    1. Tefferi A., Vardiman J.W. Classification and of myeloproliferative neoplasms: Tye 2008 World Health Organization criteria and point-of care diagnostic algotrym. Leukemia, 2008, vol. 22, pp. 14-22.

    2. Kaushansky K. The chronic myeloproliferative disorders and mutation of JAK2: Dameshek’s 54 year old speculation comes of age. Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2007, 20, pp. 5-12.

    3. Saharinen P., Silvennoinen O. The pseudokinase domain is required for suppression of basal activity of Jak2 and Jak3 tyrosine kinases and for cytokine-inducible activation of signal transduction. J. Biol. Chem., 2002, 277, pp. 47954-63.

    4. Feener E.P., Rosario F., Dunn S.L., Stancheva Z., Myers M.G. Jr. Tyrosine phosphorylation of Jak2 in the JH2 domain inhibits cytokine signaling. Mol. Cell Biol., 2004, 24, pp. 4968-78.

    5. Pietra D., Li S., Brisci A. et al. Somatic mutations of JAK2 exon 12 in patients with JAK2 (V617F)-negative myeloproliferative disorders. Blood, 2007, 111, pp. 1686-9.

    6. Tefferi A., Gangat N., Wolanskyj A.P. et al. 20 yr without leukemic or fibrotic transformation in essential thrombocythemia or polycythemia vera: predictors at diagnosis. Eur. J. Haematol., 2008, 80, pp. 386-90.

    7. Spivak J.L., Silver R.T. The revised World Health Organization diagnostic criteria for polycythemia vera, essential thrombocytosis, and primary myelofibrosis: an alternative proposal. Blood, 2008, 112, pp. 231-9.

    8. Swerdlow S.H., Campo E., Harris N.L. et al. (eds.) WHO classification of tumors of haematopoietic and lymphoid tissues, 4th edn. Lyon: IARC-press, 2008.

    9. Tefferi A., Vardiman J.W. The diagnostic interface between histology and molecular tests in myeloproliferative disorders. Curr. Opin. Hematol., 2007, 14, pp. 115-22.

    10. Harrison C.N., Green A.R. Essential thrombocythaemia. Best Pract. Res. Clin. Haematol., 2006, 19, pp. 439-53.

    11. Kiladjian J.J., Cervantes F., Leebeek F.W. et al. The impact of JAK2 and MPL mutations on diagnosis and prognosis of splanchnic vein thrombosis: a report on 241 cases. Blood, 2008, 111, pp. 4922-9.

    12. Primignani M., Barosi G., Bergamaschi G. et al. Role of the JAK2 mutation in the diagnosis of chronic myeloproliferative disorders in splanchnic vein thrombosis. Hepatology, 2006, 44, pp. 1528-34.

    Аннотация научной статьи по клинической медицине, автор научной работы — Сабурова И.Ю., Оникичук Я.С., Зотова И.И., Салогуб Г.Н., Зарайский М.И.

    Похожие темы научных работ по клинической медицине , автор научной работы — Сабурова И.Ю., Оникичук Я.С., Зотова И.И., Салогуб Г.Н., Зарайский М.И.

    Detection of JAK2V617F mutation in Patients with Myeloproliferative Disorders

    Myeloproliferative disorders (MPD) represent a heterogeneous group of hematopoietic disturbances accompanied by multiple hyperplasia of bone marrow cells. They are rather difficult to be diagnosed and are often revealed by excluding other conditions. One of the most valuable diagnostic criteria for MPD is JAK2V617F mutation . The main object of the study was to develop a routine technique for detection of JAK2V617F mutations to be of help in primary diagnosis. The genomic DNA was substracted from 58 patients by standard technique. The V617F mutation of Jak2 gene was detected with 2 pairs of primers specific to mutated and wild-type Jak2. The JAK2V617F mutation was detected with two pairs of primers specific to mutated and wild types of JAK2 gene on the UKE1 cell line (donated by Professor Boris Fehse, Germany). The suggested method proved to be rather sensitive in JAK2V617F mutation detection. The mutation rate in the combined group was 29.3 %. The frequency of JAK2V617F mutations in newly diagnosed patients with non-verified MPD was 25.7 %. Consequently the newly developed method for detection of JAK2V617F mutations can be used as a screening diagnostic method in patents with myeloproliferative disorders .

    УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XV • №4 • 2008

    И. Ю. Сабурова, Я. С. Оникичук, И. И. Зотова, Г. Н. Салотуб, М. И. Зарайский

    В ГЕНЕ Jak2 У ПАЦИЕНТОВ С ХРОНИЧЕСКИМИ МИЕЛОПРОЛИФЕРАТИВНЫМИ ЗАБОЛЕВАНИЯМИ

    Кафедра клинической лабораторной диагностики с курсом молекулярной медицины, кафедра факультетской терапии, 31 поликлиника Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова

    Хронические миелопролиферативные заболевания (МПЗ) представляют собой группу клональных нарушений гемопоэтической стволовой клетки, характеризующихся пролиферацией одной или более миелоидных линий в косном мозге и повышенным количеством зрелых и незрелых клеточных форм в крови [1]. Согласно классификации ВОЗ, МПЗ включают в себя истинную полицитэмию, эссенциальную тромбоцитэмию, идеопатический миело-фиброз и хронический миелолейкоз, плюс редкие типы патологии, такие как нейтрофильная лейкемия, гиперэози-нофильный синдром и хроническая эозинофильная лейкемия [4]. Данные патологии имеют ряд схожих клинических признаков: гиперклеточность костного мозга, увеличение количества зрелых клеток одной или нескольких линий в крови, тромбозы, кровотечения, трансформация в острый миелоидный лейкоз или миелофиброз. Диагностика этих патологий сложна и часто основывается на критериях исключения [2]. Поэтому поиск специфических признаков, позволяющих провести дифференциальную диагностику, является чрезвычайно актуальным.

    В 1960 г. был открыт первый молекулярный маркер хронического миелолейкоза - Всг/АЫ, транслокация ^9;22). Это позволило не только разработать высокоспецифичный метод диагностики, но и развить таргетную терапию и разработать методики мониторинга минимальной остаточной болезни. С тех пор перечень молекулярных маркеров, ассоциированных с гематологической патологией, постоянно расширяется.

    Одним из наиболее диагностически значимых критериев для МПЗ является наличие мутации V617F в гене Jak2 [6]. Мутация V617F в гене Jak2 определяется в 9095 % случаев истинной полицитэмии, 50-70 % случаев эссенциальной тромбоцитэмии и 40-50 % случаев мие-лофиброза [3]. Ген Jak2 экспрессирован в ранних предшественниках гемопоэза и кодирует нерецепторную ти-розинкиназу, участвующую в передаче сигнала от рецепторов цитокинов и факторов роста к ядру клетки. Мутация

    V617F вызывает конститутивную активацию рецептора без участия лиганда, что приводит к активации пролиферации клетки и блокаде процессов апоптоза.

    Таким образом, основной целью данного исследования явилась разработка простого метода детекции мутации V617F в гене Jak2, пригодной как для первичной диагностики данных патологий, так и для полуколичественной оценки минимальной остаточной болезни на фоне терапии.

    МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

    Характеристика групп пациентов

    В качестве положительного контроля использовалась клеточная линия ЦКЕ1, любезно предоставленная профессором Борисом Фезе (Германия). Данная клеточная линия несет гомозиготный генотип мутированного гена Jak2 в позиции G1849T экзон 14 (мутация V617F).

    Кровь: забор образцов производился в стерильных условиях из периферической вены или центрального катетера в вакуумный контейнер, содержащий в качестве антикоагулянта раствор ЭДТА. Объем крови составлял 10 мл.

    Костный мозг: забор аспирата костного мозга производился в стерильных условиях путем пункции грудины или крыла подвздошной кости. Образец переносился в вакуумный контейнер, содержащий в качестве антикоагулянта раствор ЭДТА. Объем пробы составлял 1 мл.

    Полученные образцы доставлялись в лабораторию не позже 1 ч после их получения.

    ности используемых праймеров: прямой (общий для дикого и мутантного аллелей) праймер Jak2-F: 5'-GGGTTTCCTCAGAACGTTGA-3' и 2 обратных праймера: Jak2-RW: 5'-TTTACTTACTCTCGTCTCCACArAC-3' на дикий тип и Jak2-RM: 5'-TTTACTTACTCTCGTCTCCACATAA-3' на мутантный тип.

    Амплификация проводилась по стандартной двухпрай-мерной схеме в конечном объеме 10 мкл. Реакционная смесь содержала 2 мкл ДНК, 14 рМол каждого праймера, смесь дНТФ в конечной концентрации 240 мкМол и 2,5 единицы термостабильной Taq ДНК-полимеразы (Helicon, Россия) в стандартном ПЦР буфере с содержанием Mg2+15 мМол. Типовая программа амплификации состояла из начальной денатурации (96 оС, 3 мин), 40 циклов, включавших денатурацию (94 оС, 20 с), отжиг праймеров (61 оС, 30 с), элонгацию (72 оС , 40 с) и заключительной элонгации (72 оС, 1 мин).

    Оценка результатов исследования

    Для проверки специфичности методики была использована клеточная линия UKE1. В качестве отрицательного контроля было использовано 10 образцов ДНК, выделенных из периферической крови стандартных доноров.

    Образцы: 1 - донор, 2 и 3 - пациенты, 4 - клеточная линия (UKE1). Проба 1 и 2 - гомозиготы по дикому типу гена Jak2, проба 3 - гетерозигота, проба 4 - гомозигота по мутантному типу гена Jak2

    це. Положительным контролем служила клеточная линия UKE1; отрицательным контролем служили образцы доноров (рисунок).

    Полуколичественная оценка результатов исследования проводилась с помощью компьютерной программы GelPro Analyzer 3.1.

    В процессе работы программа выдает количественную оценку уровней свечения сигнала в пробах в относительных единицах интенсивности (ОЕ). Суммарный сигнал с обеих дорожек (для мутированного и дикого типа гена Jak2) для каждой пробы приравнивался к 100 %. Относительная интенсивность сигнала мутированного варианта гена указывала на процентное содержание клеток опухолевого клона в пробе.

    И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

    Выявление у пациентов мутации V617F гена Jak2 является достоверным диагностическим маркером наличия хронического миелопролиферативного заболевания [6]. Общепризнанной является методика раздельной амплификации ДНК пациента с праймерами, специфичными для мутированного и дикого типа гена Jak2. В настоящей статье мы предлагаем один из адаптированных вариантов данной методики.

    УЧЕНЫЕ ЗАПИСКИ СПбГМУ ИМ. АКАД. И. П. ПАВЛОВА • ТОМ XV • N04 • 2008

    Полученные результаты частично совпали с литературными данными [2]. Расхождения могут быть связаны с малой выборкой. Причиной расхождения с литературными данными может также являться то, что данное обследование являлось проспективным, а диагноз пациентов предварительным.

    Jak2 является нерецепторной тирозинкиназой, расположенной на цитоплазматическом домене многих рецепторов цитокинов, гормонов и факторов роста. Jak2 представляет собой сложную белковую структуру, в которой наибольший интерес, с точки зрения клиники, представляют киназный и псевдокиназный домены [7]. В норме псевдокиназный домен предотвращает сближение и спонтанную самоактивацию двух киназных доменов. После связывания лиганда с рецептором в псевдокиназном домене происходят конформационные изменения, приводящие к сближению киназных доменов и их активации за счет перекрестного фосфорилирования тирозиновых оснований. Следствием этого является запуск каскада биохимических процессов, передающих сигнал от рецептора к ядру и модулирующих транскрипцию специфических генов. Таким образом, осуществляется регуляция пролиферации, созревания и выживания клетки.

    Мутация G1849T в 14 экзоне гена Jak2 приводит к замене валина на фенилаланин в позиции 617 псевдокиназ-ного домена. Это вызывает нарушение пространствен-

    Встречаемость мутации V617F гена Jak2 у пациентов в зависимости от нозологии

    Нозология ^личество пациентов Положите льная Отрицательная %

    Гиперэозино-фильный синдром 2 0 2 0

    Идеопатический миелофиброз 6 3 3 50

    Истинная 8 3 5 37,5

    Эссенциальная тромбоцитэимя 7 2 5 28,6

    Хроническое миелопролифератив-ное заболевание 35 9 26 25,7

    ной структуры тирозинкиназы, сближение киназных доменов, их спонтанную самоактивацию и появление конститутивной активности тирозинкиназы Jak2. Фенотипи-чески это проявляется активацией пролиферации и блокированием процессов апаптоза. Все эти механизмы лежат в основе патогенеза ХМПЗ, и даже гетерозиготная мутация может привести к запуску миелопролиферации. Таким образом, выявление мутации у первичных больных может служить надежным диагностическим критерием.

    Представленная методика в основном ориентирована на скрининг первичных пациентов с подозрением на ХМПЗ. Дальнейшее совершенствование данной методики с введением количественной оценки опухолевого клона может быть использовано для мониторинга МОБ при проведении стандартной химиотерапии и трансплантации гемопоэтических стволовых клеток.

    1. Dameshek, W. Some speculations on the myeloproliferative syndromes / W. Dameshek // Blood. - 1951. - № 6. - Р. 372-375.

    2. McLornan, D. Melanie Percy, Mary Frances McMullin JAK2 V617F : A Single Mutation in the Myeloproliferative Group of Disorders / D. McLorman [et al] // Ulster. Med. J. - 2006. - № 75 (2). -Р. 112-119.

    3. Ross, L. Role of JAK-STAT Signaling in the Pathogenesis of Myeloproliferative Disorders / L. Ross // Hematology. - 2006. - P. 233-239.

    4. Tefferi, А. Classification and diagnosis of myeloproliferative neoplasms : the 2008 World Health Organization criteria and point-of-care diagnostic algorithms / A. Tefferi, J. W. Vardiman // Leukemia. -2008. - № 22. - Р. 14-22.

    5. Tefferi, А. Classification, Diagnosis and Management of Myeloproliferative Disorders in the JAK2V617F Era / A. Tefferi // Hema-tology. - 2006. - P. 240-245.

    6. Wolanskyj, A. P. JAK2V617F mutation in essential thrombocy-thaemia : clinical associations and long-term prognostic relevance / A. P. Wolanskyj [et al] // Br. J. Haematol. - 2005. - № 131 (2). -Р. 208-213.

    7. Yamaoka, K. The Janus kinases (Jaks) / K. Yamaoka [et al] // Genome Biology. - 2004. - № 5. - Р. 253.

    И. Ю. Сабурова, Я. С. Оникичук, И. И. Зотова,

    Г. Н. Салотуб, М. И. Зарайский

    Определение мутации V617F в гене Jak2 у пациентов с хроническими миелопролиферативными заболеваниями

    группе составила 29,3 %. Процент встречаемости мутации V617F в гене Jak2 в группе первичных пациентов с невирифицирован-ным диагнозом МПЗ составил 25,7 %. Таким образом, разработанный нами метод определения мутации V617F в гене Jak2 может быть использован в качестве скрининговой диагностики у пациентов с невирифицированными хроническими миелопролифератив-ными заболеваниями.

    Ключевые слова: миелопролиферативные заболевания, мутация V617F в гене Jak2, ПЦР.

    I. Y. Saburova, Y. S. Onikichuk, I. I. Zotova,

    G. N. Salogub, MI. I. Zarayskiy

    Detection of JAK2V617F mutation in Patients with Myeloproliferative Disorders

    Myeloproliferative disorders (MPD) represent a heterogeneous group of hematopoietic disturbances accompanied by multiple

    hyperplasia of bone marrow cells. They are rather difficult to be diagnosed and are often revealed by excluding other conditions. One of the most valuable diagnostic criteria for MPD is JAK2V617F mutation. The main object of the study was to develop a routine technique for detection of JAK2V617F mutations to be of help in primary diagnosis. The genomic DNA was substracted from 58 patients by standard technique. The V617F mutation of Jak2 gene was detected with 2 pairs of primers specific to mutated and wild-type Jak2. The JAK2V617F mutation was detected with two pairs of primers specific to mutated and wild types of JAK2 gene on the UKE1 cell line (donated by Professor Boris Fehse, Germany). The suggested method proved to be rather sensitive in JAK2V617F mutation detection. The mutation rate in the combined group was 29.3 %. The frequency of JAK2V617F mutations in newly diagnosed patients with non-verified MPD was 25.7 %. Consequently the newly developed method for detection of JAK2V617F mutations can be used as a screening diagnostic method in patents with myeloproliferative disorders.

    Key words: myeloproliferative disorders, JAK2V617F mutation, PCR.

    Д. В. Дзадзуа, А. С. Захарова, Л. Н. Новикова, В. А. Воинов, К. С. Карчевский, Р. В. Чеминава, О. Э. Бакланова

    ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПЛАЗМАФЕРЕЗА У БОЛЬНЫХ ИДИОПАТИЧЕСКИМ ФИБРО-ЗИРУЮЩИМ АЛЬВЕОЛИТОМ

    НИИ пульмонологии Санкт-Петербургского государственного медицинского университета имени академика И. П. Павлова

    Интерстициальные заболевания легких (ИЗЛ) составляют 10-15 % в структуре всех болезней легких. К ним относятся более 200 нозологий известной и неизвестной этиологии [7]. Одним из наиболее распространенных и прогностически неблагоприятных заболеваний является идиопатический фиброзирующий альвеолит. Идиопа-тический фиброзирующий альвеолит (ИФА) (синонимы: криптогенный фиброзирующий альвеолит, идиопатический фиброз легких, болезнь Хаммена-Рича и др.) представляет собой своеобразный патологический процесс в легких неясной природы, характеризующийся нарастающей дыхательной недостаточностью вследствие развития преимущественно в интерстициальной ткани легких небактериального воспаления, ведущего к прогрессирующему интерстициальному фиброзу [3].

    ИФА - заболевание, в развитии которого определенную роль играют иммунные механизмы, о чем свидетельствует присутствие активированных лимфоцитов, макрофагов, нейтрофилов и эозинофилов в легких.

    Существенные отклонения от нормы определяются и в системе Т-клеточного иммунитета.

    В связи с тем, что степень отклонения иммунологических показателей от нормы зависит от особенностей течения болезни, в литературе описаны существенные различия в оценке иммунологической реактивности больных ИФА. Исследования, проведенные Т. П. Сесь и соавт. (2000), свидетельствуют о том, что при ИФА наиболее информативными являются изменения следующих показателей: повышение общего числа эффекторных клеток в жидкости бронхоальвеолярного лаважа (ЖБАЛ) - альвеолярных макрофагов, нейтрофилов, лимфоцитов, увеличение числа Т-лимфоцитов (Т-хелперов), повышение активности интер-лейкинов (ИЛ-1Р, ИЛ-2), пролиферативной активности Т-лимфоцитов, активности протеолитических ферментов -эластазы и коллагеназы. Отклонение показателей гуморального иммунитета - иммуноглобулины трех основных классов (А, G и М) и циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) - служит критерием интенсивности аутоиммунных процессов в организме [3]. Поэтому оценка иммунологического статуса при ИФА имеет важное значение в решении вопросов лечебной тактики.

    Для лечения больных ИФА используются кортикосте-роиды, иногда в сочетании с иммунносупрессантами и антифибротическими препаратами ф-пеницилламин и др.). Наряду с медикаментами, применяются и эфферентные методы лечения, главным образом плазмаферез (ПФ). Положительный эффект ПФ заключается в элиминации аутоантител и циркулирующих в крови иммунных комплексов, которые играют важную роль в развитии ИФА. ПФ повышает чувствительность к кортикостерои-дам [4], удаляя аутоантитела и ЦИК, улучшает микроциркуляцию, способствует нормализации основных метаболических процессов [1].

    Однако до настоящего времени эффективность эфферентных методов при ИФА вызывает сомнения, не дока-

Читайте также: