Генистеин при раке молочной железы

Фитоэстрогены, как изофлавоны даидзеин и генистеин, защищают от хронических заболеваний, распространенных в западных странах, таких как рак, остеопороз и ишемическая болезнь сердца. Кроме того, существуют опасения относительно вредного воздействия гормоноподобных соединений, особенно в отношении развития детей грудного возраста[11002128]

Примерами продуктов на основе сои, которые содержат генистеин и даидзеин, являются обработанные продукты, хлебобулочные изделия и комбинированные продукты, такие как салаты (содержащие изюм, рис, нут, фасоль, сдобные бобы и ростки фасоли), десерты и смешанные овощные блюда.

продукт	даидзеин (мг на 100 г)	генистеин (мг на 100 г)
Соевые бобы вареные *	1500	32000
Мисо *	20000	31000
Ростки фасоли (мунг) *	39000	6800
Бобы*	7	6
Брокколи, Калабрезе †	5	7
Морковь *	nd	nd
Морковь †	2	2
Клюква*	5	21
Клюква †	0	0
Зеленый горох колотый *	13	35
Зеленый горох колотый †	8	0
Грибы *	1	21
Грибы †	20	12
Хлеб белый	135-6	157-2
Хлеб из цельного зерна	371-3	456-7
Овсяная каша	3-5	6-0
Кофе эспрессо (30 мл)	17	6
* Концентрации, на основе веса во влажном состоянии.
† Концентрации в сухом весе.

Суп Мисо производится путём брожения соевых бобов, риса, пшеницы или смеси из них с помощью специального вида плесневых грибов Aspergillus oryzae. (wiki)

продукт	генистеин +даидзеин (мг на 100 г)
Нут, приготовленный	24-1
Чечевица	0-5
Брокколи	1-8
Помидоры сырые	3-25
Фруктовый коктейль сиропом	1-54
Апельсины	—
Морковь, молодая, вареная	—
Фруктовый коктейль из сока	1-54
Грейпфрут	—
темный изюм (Raisins)	186-6
изум коричневый(Currants)	224-5
изюм белый (Sultanas)	204-1

Функция яичников и здоровье женской репродуктивной системы в значительной степени зависят от действия эстрогена на его ткани-мишени в организме. Взрослые женщины в репродуктивном возрасте имеют строго регулируемые циклические уровни эстрогена с отрицательной и положительной обратной связью на гипоталамус и переднюю часть гипофиза. Изменения либо в циклической природе этих гормонов, либо в вырабатываемых уровнях могут влиять на функцию яичников и, следовательно, на фертильность. Поскольку соевые продукты содержат эстрогенные вещества, были проведены исследования для оценки уровней фитоэстрогенов в этих продуктах питания и того, являются ли эти уровни достаточными, чтобы препятствовать размножению. Продукты, содержащие сою, сильно различаются по своему содержанию, а уровень фитоэстрогенов очень широк (USDA database). Уровни фитоэстрогенов, которые мы потребляем, могут быть важнее, чем количество самой сои, когда мы думаем о размножении, потому что эстрогены играют такую ​​большую роль. Существует некоторая осторожность, указанная в нескольких исследованиях, рассмотренных в этой статье. Эти данные свидетельствуют о том, что потребление соевого белка в избытке (> 100 мг изофлавонов сои / сут) может привести к снижению функции яичников, что определяется более низким уровнем циркулирующих гормонов, при этом наиболее распространенным признаком является снижение уровня гонадотропина. Это особенно верно в отношении женщин в пременопаузе в репродуктивном возрасте, когда это снижение может оказать наибольшее влияние.

По большей части исследования, проведенные до настоящего времени, предполагают, что диета, содержащая более низкие уровни сои, например 1–2 порции сои в день, как часть хорошо сбалансированной диеты, не должны оказывать вредного влияния на функцию яичника, так как это связано с овуляцией. Эти уровни сходны с таковыми в традиционной азиатской диете (изофлавоны 10–25 мг / сут), и даже изофлавоны до 50 мг / сут мало влияют на уровень циркулирующих в сыворотке гормонов, участвующих в репродукции. Хотя уровни фитоэстрогенов, обычно обнаруживаемых в соевых продуктах, представляют минимальный риск для взрослой женщины, женская репродуктивная система зависит от гормонов для правильного функционирования, и фитоэстрогены на очень высоких уровнях могут мешать этому процессу.(20980642).

В этом (31099163) исследовании проверяли как на клетки рака молочной железы, которых лечили 10-8 М 17β-эстрадиолом (Е2), действуют одни из трех фитоэстрогенов (генистеин, ресвератрол и кверцетин, 10-7 М), и комбинацией Е2 и один из трех фитоэстрогенов в течение 48 ч. РЕЗУЛЬТАТЫ:
Жизнеспособность клеток рака молочной железы ингибировалась всеми фитоэстрогенами, но индуцировалась E2 с фитоэстрогеном или без него. Апоптотические клетки, а также белки, участвующие в апоптотическом пути и рецептор эстрогена (ER) β, были значительно увеличены в клетках, обработанных одним фитоэстрогеном. Использование E2 с или без фитоэстрогена показало совершенно противоположные результаты. Белки, участвующие в пролиферативном пути и экспрессии ER, были увеличены в культурах с E2 с фитоэстрогенами или без них.ЗАКЛЮЧЕНИЕ:
В присутствии E2 эти фитоэстрогены теряют эффекты подавления клеток рака молочной железы; напротив, стимулируют ростостимулирующие эффекты, подавляя апоптоз и стимулируя пролиферацию в первичных клетках рака молочной железы. Таким образом, влияние фитоэстрогенов на рак молочной железы следует рассматривать как E2, все еще присутствующий в ткани рака молочной железы. Это еще одно доказательство того что химипрофилактику нужно начинать уже после того как все классические процедуры назначенные вам врачем уже выполнены.

В этой (26841510) статье мы изучаем эффект синтетического изофлавоноидного генистеина против раковых клеток HeLa, которые содержат эстрогенные рецепторы альфа, но не бета, с целью определения цитотоксического или цитопротективного эффекта генистеина. Показано, что значение половинной максимальной ингибирующей концентрации (IC50) генистеина (0,2 мМ) для ингибирования роста клеток HeLa, по меньшей мере, в десять раз выше, чем у препаратов тамоксифена и цисплатина, используемых при лечении рака шейки матки. В микромолярных концентрациях (0,1-10 мкМ) генистеин снижал цитотоксическое действие цисплатина и тамоксифена. Пониженная экспрессия мРНК Bax и повышенная экспрессия мРНК Bcl-2 после инкубации клеток с генистеином также демонстрируют цитопротективный, антиапоптотический эффект генистеина. Генистеин даже в высоких концентрациях, не влиял на мембранный потенциал и кальциевую емкость изолированных митохондрий, не активируя открытие Ca (2 +) — индуцированной поры митохондрий. Таким образом, эти данные демонстрируют цитопротекторное действие изофлавоноидного генистеина против раковых клеток этого типа.

Диетический генистеин ингибирует метастазирование рака простаты человека.(18339885)

Генистеин уменьшил процент метастатической нагрузки в легких в 10 раз. Эти результаты указывают на то, что диетическое вмешательство после операции по удалению ракамолочной железы может повлиять на рост MDA-MB-435 / HAL опухолевых клеток. (15833874)

Генистеин — это соевый изофлавон, действующий как естественный ингибитор NF-κB [30560046]. Генистеин связан с противоопухолевыми эффектами при различных злокачественных новообразованиях, особенно при раке молочной железы и простаты. Исследование, оценивающее действие генистеина in vitro и in vivo, проводили на клетках рака молочной железы MCF-7 и на голых мышах. Генистеин ингибировал стволовые клетки рака молочной железы посредством подавления сигнального пути Hedgehog-GLI1 [24331293]. Кроме того, было обнаружено, что генистеин ингибирует стволовость клеток SKOV3, индуцированных макрофагами, совместно культивируемыми со стволовыми клетками рака яичника, таким образом становясь потенциальным химиопрофилактическим средством при раке яичников . Генистеин нарушал взаимодействие между OCSLC и макрофагами THP-1, блокируя IL-8 / STAT3, изменяя поляризацию M2 макрофагов и подавляя стебель клеток SKOV3 в системе совместного культивирования и коинъекции у голых мышей [30646963]. 7-Дифторметоксил-5,4′-ди-н-октилгенистеин (DFOG) является новым синтетическим аналогом генистеина. DFOG ингибирует стволоподобные свойства и обратный фенотип EMT в стволовых клетках рака желудка in vitro [27279287].

Подавление генистеином экспрессии матриксной металлопротеиназы 2 (ММР-2) и фактора роста эндотелия сосудов (VEGF) в мезенхимальных стволовых клетках, подобных клеткам, выделенным из глиом высокого и низкого уровня.Клетки глиомы низкой степени тяжести кажутся гораздо более чувствительными к генистеину, и этот изофлавон может предложить соответствующее терапевтическое вмешательство у этих пациентов. Генистеин является членом семейства изофлавоноидов, которые оказывают противоопухолевые эффекты. Здесь мы оценили влияние генистеина на экспрессию MMP-2 и VEGF в глиомах низкой и высокой степени in vitro.(28125877)

Генистеин смягчает повреждение ДНК, нацеленное на митохондрии, вызванное β-амилоидными пептидами 25-35 в клетках глиомы С6. (23519932)

Наши результаты подтверждают обратную связь глиомы с более высоким диетическим антиоксидантным индексом и с более высоким потреблением определенных фитоэстрогенов, особенно даидзеина.(16749939)

Генистеин – соединение, с которым сталкивался практически каждый. По своему действию напоминает женские половые гормоны – эстрогены. Входит в класс изофлавонов. Содержится в соевых бобах и продуктах, получаемых из сои. Также есть несколько препаратов против остеопороза с генистеином. Сегодня достаточно исследований, в которых утверждается, что данное вещество может навредить. В частности, заметно возрастает риск бесплодия у мужчин и женщин.

Гормоны против остеопороза – история проб и ошибок

С 1938 года в США для борьбы с нарушениями здоровья, вызванными менопаузой, в том числе с остеопорозом, применялась гормонозаместительная терапия (ГЗТ). Вначале все шло превосходно, но побочные эффекты заставили пересмотреть отношение ученых к такому методу. В 1975 году британские специалисты заявили, что лечение гормонами повышает риск рака матки на 40 %. Поэтому исследователи стали искать новые пути. В США решили использовать генистеин – фитоэстроген сои.

А стать соевым бобам частью медицинского рынка помогло наблюдение за жителями Юго-Восточной Азии. Известно, что они редко страдают от заболеваний сердца и остеопороза, при этом соя занимает важную часть их рациона. Впрочем, сегодня ученые заявляют о том, что это растение переоценили, ведь ошибочно делать выводы об его исключительной ценности на основании одного фактора – пищевого. На здоровье влияют также климат, традиции и привычки.

Звездный час генистеина пришелся на начало 2000-х годов, когда были разработаны препараты от остеопороза с этим компонентом. Но за 20 лет накопились исследования вещества, которые пошатнули образ безупречного борца с остеопорозом. Дело в том, что генистеин действует противоречиво – иногда ведет себя подобно эстрогенам, а порой блокирует их.

Генистеин может провоцировать бесплодие у женщин

Чувствительный удар по авторитету генистеина нанесло исследование 2008 года университета Северной Каролины (США). Научная работа с описанием эксперимента была опубликована в журнале Neurotoxicology. Ее авторы проверили на крысах действие генистеина. Животных изучали, начиная от рождения до появления у них детенышей. Провели серию опытов и выяснили, что вещество деструктивно влияет на гипоталамус – отдел мозга, который обеспечивает овуляцию и половое созревание.

Если точнее, генистеин угнетал выработку гонадотропин-рилизинг-гормона, количество которого возрастает в период созревания яйцеклетки. А это серьезно повышает риск бесплодия.

Также у животных рано начинались нарушения менструального цикла. Если спроецировать ситуацию на человека, то прием вещества может вызвать ранний климакс. Другой нежелательный эффект от приема генистеина – раннее половое созревание. Автор исследования доктор Хизер Пэтисол (Patisaul H.) считает, что на людей фитоэстроген сои будет действовать похожим образом.

В исследовании указывается, что генистеин способен проникать через плацентарный барьер. Если вещество принимала женщина, будучи беременной, то в организм ребенка оно тоже поступит. Это приведет к всплеску гормонов у последнего спустя несколько лет.

Продолжили изучать оборотную сторону генистеина коллеги Пэтисол – Сандра Лоса и Карина Тодд (Losa S., Todd K.) из того же университета. Исследовательницы выяснили, что этот изофлавон сои нарушает срок развития яичников.

Казалось бы, препараты с данным веществом принимают женщины, которые уже вышли из детородного возраста, а потому им опасаться нечего. Однако, этот довод не так убедителен, каким кажется. Часть дам начинает принимать БАДы с генистеином до наступления менопаузы – для профилактики заболеваний. А если учесть, что все больше женщин рожает и после 40 лет, то опасность действительно высока.

Итак, генистеин может спровоцировать ранний климакс, что грозит снижением прочности костной ткани. А потому о его эффективном противодействии остеопорозу речи не может быть в принципе.

Генистеин и мужское бесплодие – связь доказана

Препараты на основе сои против остеопороза содержат фитоэстрогены, что делает невозможным их прием для мужчин, поскольку эти вещества препятствуют выработке тестостерона. А без него полноценная жизнь мужской части населения невозможна.

Между тем остеопороз представляет угрозу для сильного пола, а потому препарат, укрепляющий кости, им необходим. По статистике ВОЗ, почти 20 % мужчин получает переломы по вине этого заболевания. Можно ли принимать мужчине препарат с генистеином? Если он решил навсегда забыть о детородной функции, тогда ответ будет утвердительным.

В том, что вещество наносит значительный вред, уверен доктор Хорхе Чаварро (Chavarro J.) из Гарвардского института здравоохранения. Вместе с коллегами он обследовал 99 мужчин, которые обратились за помощью с жалобами на бесплодие. В анализах спермы пациентов, потребляющих много сои, количество сперматозоидов оказалось сниженным. В норме их концентрация составляет 80-120 миллионов в одном эякуляте, у подопечных же Чаварро эта цифра была на 41 миллион ниже.

Ученые Великобритании также встревожены не на шутку. Профессор Шина Льюис (Lewis S.) из Королевского университета Белфаста считает, что особенно опасен генистеин для плода мужского пола и новорожденного мальчика. Его прием может привести не только к снижению числа сперматозоидов, но и к неправильному развитию полового органа. А ведь фитоэстроген сои с легкостью переходит от матери к ребенку во время беременности.

Также из-за действия вещества на гормональную систему ребенка исключается возможность применения препаратов из сои при ювенильном остеопорозе.

Представляет интерес исследование Университета Стелленбоса (ЮАР), в котором участвовало по 200 человек обоих полов. Рацион с генистеином снижал уровни сывороточного дегидроэпиандростерона сульфата (DHEAS) как у мужчин, так и у женщин. Это стероидный гормон, который по структруре похож на тестостерон, и в организме легко в него переходит. (Swart A., Johannes I.).

Прием соевых компонентов способен привести к раку

Больше всего ученых, работающих с этой темой, волнует вопрос о том, может ли генистеин ускорить рост опухоли. В первую очередь это касается онкологического заболевания молочной железы. И сегодня научных публикаций достаточно, чтобы говорить об опасности вещества – по крайней мере, для некоторых групп населения. Стоит назвать работу ученого Техасского университета Клинтона Оллреда (Allred С.)

Вместе с коллегами он доказал, что диета с высоким содержанием генистеина стимулировала развитие опухоли молочной железы у мышей с удаленными яичниками. При этом патогенное воздействие было сильнее в группе, получавшей очищенные компоненты сои – генистеин и генестин. Животные, питавшиеся соевой мукой, пострадали меньше.

Столь убедительные доказательства поставили данное вещество под угрозу запрета в Европе. Пользу и вред сои тщательно изучают в Германии. Сенатская комиссия по безопасности пищевых продуктов Немецкого исследовательского фонда (SKLM) рекомендует избегать продуктов на основе сои группе риска. В нее входят люди с дефицитом йода, гипотиреозом, врожденной дисфункцией щитовидной железы. Также не следует их употреблять женщинам, у которых обнаружен рак молочной железы. Кроме того, генистеин не стоит принимать во время беременности. Об этом сообщает в своей работе ученый из Ганновера С. Хьюзер. (S. Hüser)

Китайские исследователи доказали, что раковые клетки типа OVCAR-5 при обработке генистеином в пробирке начинают расти. Такой эффект потенциально может вызывать рак яичников. (Wang Y., Li W.)

Генистеин и щитовидная железа: в группе риска женщины в менопаузе

Действие генистеина, как и другие изофлавоны сои, на щитовидку точно нельзя назвать позитивным. Об этом говорится в исследовании японских авторов (Kimura S., Suwa J.). Эти ученые заявляют, что особенно опасно данное вещество людям с дефицитом йода. У крыс, которых кормили обезжиренной соей без йода, развивался гиперпластический зоб, а в железе были обнаружены злокачественные опухоли. При добавлении в рацион йода состояние щитовидной железы улучшалось – она принимала обычные размеры.

Интерес представляет и работа Даниэля Доерджа и Даниэля Шихана. (Doerge D. , Sheehan D.). В ней ученые указывают, что генистеин снижает выработку пероксидазы, которая необходима для синтеза гормонов щитовидки – трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4). По их данным, активность пероксидазы под действием сои снижалась на 80%. Все это следует иметь в виду при выборе препарата от остеопороза, особенно если учесть уязвимость щитовидки и молочных желез у женщин в менопаузе.

Соя и ГМО – почти синонимы

Есть еще один аспект, который нельзя обойти стороной при разговоре о генистеине. Сегодня 90 % всей выращиваемой в мире сои является генномодифицированной. Хотя сторонники ГМО-продукции утверждают, что она безопасна и прошла необходимые испытания, ее противников достаточно. И они тоже опираются на исследования. Главный довод критиков трансгенной еды – неизвестны последствия, которые она окажет спустя время.

Употреблять продукцию из соевых бобов, в том числе и БАДы с генистеином, или нет, каждый волен решать сам. Но игнорировать факты, подтверждающие его нежелательное действие, было бы ошибкой.

Краткая история

Введение.

Видное место среди растений, применяемых для лечения гормонозависимых опухолей (более 40% всех опухолей), занимают травы с высоким содержанием фитоэстрогенов. Их лечебный эффект связывают со способностью к избирательной блокаде эстрогеновых (и андрогеновых) рецепторов на клетках опухолей, а также с изменением активности некоторых ферментных систем, участвующих в синтезе и метаболизме гормонов.
Научные изыскания последних лет указывают на наличие у фитоэстрогенов противоопухолевой активности, не имеющей отношения к эндокринной регуляции. В частности, доказана способность флавоноидов индуцировать и усиливать апоптоз, блокировать действие ростовых факторов на клетку и моделировать иммунные реакции по отношению к злокачественной клетке. В связи с этим противоопухолевый эффект фитоэстрогенов был зарегистрирован в экспериментах с опухолями, не имеющими гормональной зависимости (толстый кишечник, легкие, печень и др.).
Факт гормональной зависимости опухолей молочной железы, эндометрия, предстательной железы в настоящее время ни у кого не вызывает сомнений, так же как и объективность эффекта антигормональной терапии. Однако вопрос о применении лекарственных растений в этой области нельзя считать до конца определенным. С одной стороны, известно онкопрофилактирующее действие фитоэстрогенов сои при раке молочной железы. С другой стороны, логично было бы ожидать от растения с высокой гормональной активностью провоцирующего усиление роста. В связи с этим нам показалось важным определить показания и противопоказания к применению ФЭ-содержащих растений в онкологии. Для этого решались следующие задачи:

1. Проводился анализ молекулярных эффектов фитоэстрогенов

2. Оценивалось распределение ФЭ по эстрогеноподобной активности

3. Формировался список растений в соответствии с содержанием ФЭ

Классификация фитоэстрогенов

Чаще всего встречается упрощенная классификация фитоэстрогенов по химическому строению, в которой выделяются 3 группы:

1. Изофлавоны (генистеин, дайдзеин, апигенин, биоханин и т.д.)

2. Лигнаны (энтеродиол, энтеролактон)

3. Куместаны (куместрол, веделолактон, пликадин)

Внутри первой группы химики выделяют порядка 15-17 подгрупп, что для медицинской практики пока не имеет особенного значения. К изофлавонам относят генистеин, дайдзеин, апигенин, кверцетин и другие вещества. Лигнаны представлены в основном двумя соединениями – энтеродиолом и энтеролактоном. Куместаны рассматриваются на примере куместрола.
Имеются групповые различия в эффектах. Однако эффекты изофлавонов существенно различаются, несмотря на принадлежность их к одной химической группе. Таким образом, с точки зрения фармаколога далеко не всегда имеет смысл классифицировать действующие вещества растений по химическому признаку. Гораздо интереснее было бы видеть классификацию по силе эстрогенного эффекта, по степени аффинитета к эстрогеновым рецепторам, по преимущественному влиянию фитоэстрогенов на тот или иной подтип рецепторов, и как следствие, на тот или иной гормонозависимый орган. Можно предложить еще несколько признаков, по которым имело бы смысл классифицировать фитоэстрогены для пользы клинической практики. К сожалению, количество научной информации о фитоэстрогенах (хоть и довольно уже большое) еще не перешло в новое качество, для которого характерны были бы подобные классификации.

Фармакологические эффекты ФЭ, связанные с эндокринной регуляцией

При изучении механизмов влияния фитоэстрогенов на клетки гормонозависимых органов, а также системные аспекты гормональной регуляции, чаще всего обсуждаются:

1. Селективная модуляция эстрогеновых (андрогеновых) рецепторов

2. Изменение активности ароматазы и других ферментов стероидогенеза

3. Оптимизация печеночного и кишечного метаболизма гормонов

Сводная таблица растений, содержащих фитоэстрогены.

Существование стволовых клеток рака молочной железы (BCSCs) имеет глубокие последствия для профилактики рака. Генистеин, преобладающий изофлавон, обнаруженный в соевых продуктах, обладает многочисленными устойчивыми противоопухолевыми эффектами при различных раковых заболеваниях, особенно при раке молочной железы и предстательной железы. В этом исследовании мы стремились оценить генистеин-ингибирование BCSC и его потенциальный механизм путем культивирования клеток рака молочной железы MCF-7 и имплантации этих клеток в голых мышей.

Для оценки влияния генистеина на рост, пролиферацию и апоптоз клеток рака молочной железы использовали подсчет клеток, образование колоний и анализ апоптоза клеток. Затем мы использовали анализ образования маммосферы и окрашивание CD44CD24 для оценки влияния генистеина на BCSCs in vitro. Модель ксенотрансплантации голых мышей использовалась для определения того, может ли генистеин нацеливаться на BCSC in vivo, как оценивается полимеразной цепной реакцией в реальном времени (ПЦР) и иммуногистохимическим окрашиванием. Потенциальный механизм исследовали с использованием ПЦР в реальном времени, анализа вестерн-блоттинга и иммуногистохимического окрашивания.

Генистеин ингибировал рост и пролиферацию клеток рака молочной железы MCF-7 и способствовал апоптозу. Как in vitro, так и in vivo genistein уменьшали стволовые клетки рака молочной железы и ингибировали стволовые клетки рака молочной железы посредством понижающей регуляции пути сигнализации Hedgehog-Gli1.

Мы впервые продемонстрировали, что генистеин ингибирует BCSC с помощью регулирующего сигнала Hedgehog-Gli1. Эти данные дают поддержку и обоснование для изучения клинического применения генистеина при лечении рака молочной железы и, в частности, нацеливания на стволовые клетки рака молочной железы.

Рак молочной железы остается одним из наиболее часто диагностируемых видов рака в мире. В азиатских странах, особенно в Китае и Японии, по-видимому, из-за диеты и других факторов окружающей среды, заболеваемость раком молочной железы значительно ниже, чем в западных странах. Недавние эпидемиологические и экспериментальные исследования дали убедительные доказательства того, что генистеин в богатой соей пищей способствует снижению заболеваемости раком молочной железы 2. Генистеин (4,5,7-тригидроксиизофлавон), природный изофлавоновый фитоэстроген, обнаруженный в соевых бобов, имеет множество функций по противоопухолевым эффектам [4]. Кроме того, было высказано предположение, что генистеин может преодолеть резистентность к лекарственным средствам и ингибировать рецидив / рецидив рака [4,5].

Многие опухоли человека содержат раковые стволовые клетки, которые обладают способностью к самообновлению, хеморезистентностью и повышенной опухолегенностью [6]. Фактически, концепция, что раковые образования возникают из стволовых клеток или зародышевых клеток, была впервые предложена почти 150 лет назад. Считается, что стволовые клетки рака играют ключевую роль в развитии рака, метастазировании и рецидиве. Имеются убедительные доказательства того, что многие виды рака, включая рак молочной железы, инициируются и поддерживаются небольшой популяцией раковых стволовых клеток [7,8]. Строгоподобные клетки рака молочной железы (BCSC) представляют собой небольшую популяцию в основном покоящихся клеток, определяемых их долгой жизнью, высокой клоногенностью, самовоспроизводящимся потенциалом, пластичностью и лекарственной устойчивостью [9]. Общая стратегия комбинированной химиотерапии и лучевой терапии рака молочной железы, нацеленная на BCSC, получила широкое внимание.

Исследователи обнаружили, что несколько диетических соединений являются перспективными химиопрепаратами против раковых стволовых клеток, таких как сульфорафан и куркумин [10,11]. Montales и его коллеги первыми продемонстрировали, что ингибирование генистеина в формировании маммосферы имитировалось пептифозином Akt и ассоциировалось с усиленной опухолевой супрессорной фосфатазой и гомологией тензинов, удаленной по экспрессии хромосомы 10 (PTEN) [12]. Диеты, богатые фруктами и овощами, участвуют в снижении риска рака молочной железы, но лежащие в основе механизмы плохо изучены. Хорошо известно, что дерегулирование некоторых путей ингибирует опухолегенез с использованием сигнальных путей рака стволовых клеток, таких как Hedgehog, Notch и Wnt / β-catenin при раке молочной железы [13]. Путь Hedgehog регулирует эмбриональное развитие как беспозвоночных, так и позвоночных и способствует образованию различных органов и тканей, включая нервную трубку. Затем были идентифицированы три гомолога гена этого млекопитающего: Sonic hedgehog (Shh), индийский еж и пустынный ежик. Shh является наиболее широко изученным и наилучшим образом охарактеризованным [14]. Рецептор Patched (Pchch) представляет собой 12-трансмембранный белок, который действует каталитически, чтобы ингибировать 7-трансмембранный белок Smoothened (Smo), делая путь неактивным в отсутствие лиганда Hedgehog. Связывание лиганда Hedgehog инактивирует Ptch, депрессируя Smo и приводя к положительной сигнальной сигнатуре Hedgehog. Когда Smo неактивен, многопротеиновый комплекс конститутивно обрабатывает белки Gli до коротких, транскрипционно репрессивных форм. Семейство Gli содержит Gli1, Gli2 и Gli3, которые разделяют пять высококонсервативных тандемных доменов цинкового пальца C2H2 и гистидин-цистеин-линкерную последовательность между пальцами цинка. В человеке Gli1 действует как активатор, Gli2 в качестве активатора или в качестве репрессора в зависимости от его каталитического эффекта, а Gli3 в качестве репрессора 16.

В настоящем исследовании мы оценили эффективность и механизмы генистеина, подавляющие популяцию BCSC из клеток рака молочной железы человека MCF-7, путем изучения роста опухоли in vivo, образования маммосферы in vitro и экспрессии Hedgehog.

Генистеин получали из Sigma-Aldrich (St Louis, MO, USA) и растворяли в диметилсульфоксиде (ДМСО) в разных дозах для экспериментов. В качестве контроля на транспортном средстве использовались равные объемы обработки ДМСО. Все остальные материалы имели аналитический сорт и были получены из коммерческих источников.

Клеточная линия рака молочной железы человека MCF-7 была приобретена в сотовом банке типовой коллекции китайской академии наук, Шанхайский институт клеточной биологии, Шанхай, Китай. Клетки соответственно культивировали в модифицированной Дульбекко среде Eagle (HyClone, Logan, UT, USA), дополненной 10% фетальной бычьей сывороткой (HyClone). Все клетки поддерживали при 37 ° С, в 5% углекислого газа и относительной влажности 95%.

Для ингибирующих рост исследований клетки MCF-7 высевали в 96-луночные планшеты с плотностью 3 × 104 клеток / лунку. Клетки инкубировали с генистеином в концентрациях 0, 2,5, 5, 10, 15, 20, 30, 50 и 70 мкМ в течение 48 часов. После добавления раствора Cell-Assay Kit-8 (Sigma-Aldrich) в клетки / лунку клетки инкубировали еще 2 часа. Поглощение измеряли с помощью считывателя микропланшетов при 450 нм. Количество формазан-красителя, генерируемого активированными дегидрогеназами в клетках, прямо пропорционально количеству живых клеток. В качестве пустой контрольной группы использовали добавление среды. Для оценки скорости ингибирования роста клеток рассчитывали концентрацию, которая ингибирует 50% роста контрольных клеток. Все эксперименты проводились три раза независимо.

Клетки MCF-7 обрабатывали генистеином в концентрациях от 0 до 15 мкМ в течение 48 часов. Жизнеспособные клетки подсчитывали и высевали для анализа образования колоний в 6-луночных планшетах при 300 клеток / лунку. Во время роста колонии культуральную среду заменяли каждые 3 дня. Колонии с более чем 50 клетками подсчитывали под инвертированным микроскопом (Olympus, Япония) на 7-й день после посева, чтобы рассчитать скорость образования:

ставка
знак равно
номер

Каждый эксперимент проводили в трех экземплярах.

Клеточный апоптоз анализировали с помощью проточной цитометрии. Вкратце, 1 × 106 клеток собирали и промывали в забуференном фосфатом физиологическом растворе после обработки с разной концентрацией генистеина в течение 48 часов. После промывания забуференным фосфатом физиологическим раствором клетки ресуспендировали в 500 мкл связывающего буфера и инкубировали с 5 мкл флуоресцеинового изотиоцианата (FITC) -Аннексин-V (BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США) и 10 мкл иодида пропидия (BD Biosciences ) в течение 15 минут при 4 ° C в темноте. Апоптоз измеряли с использованием проточной цитометрии для количественного определения уровней фосфатидилсерина на внешней мембране апоптозных клеток. Результаты анализировали с помощью проточной цитометрии с использованием клеточного сортировщика BD FACS Aria (BD, Franklin Lakes, NJ, USA). Этот эксперимент повторяли три раза.

Маммоферообразующий анализ проводили, как описано ранее, с небольшой модификацией [18]. Вкратце, клетки высевали в 6-луночные планшеты с ультра-низким прилипанием (Corning, Acton, MA, USA) с плотностью 20 000 клеток / мл в первичной культуре и 1000 клеток / мл в проходах, которые были дополнены 2 ммоль / l l-глутамин (ATCC, Manassas, VA), 2% B27 (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA), 20 нг / мл рекомбинантного эпидермального фактора роста человека (Sigma-Aldrich) и 20 нг / мл основного фактора роста фибробластов (Sigma-Aldrich), 4 мкг / мл гепарина и 5 мкг / мл инсулина (Sigma-Aldrich). Маммосферы подсчитывали после культивирования в течение 7 дней под микроскопом Nikon Eclipse TE2000-S (Япония), и фотографии были приобретены с помощью Meta Morph.

Сообщалось, что популяция клеток рака CD44 + и CD24 — ранее была включена в BCSC [19]. После обработки генистеина в течение 48 часов клетки MCF-7 окрашивали конъюгированным с фикоэритрином антителом против CD24 человека (Invitrogen) и конъюгированным с FITC антителом против CD44 человека (Invitrogen) в соответствии с инструкциями производителя. Образцы анализировали с использованием проточного цитометра FACS Calibur и программного обеспечения Cell Quest (BD).

Все исследования с участием мышей были одобрены Комитетом по уходу и использованию животных Даляньского медицинского университета (Далянь, Китай). Пятнадцать 6-недельных до 8-недельных женщин-обнаженных мышей были приобретены в Экспериментальном центре животных Даляньского медицинского университета. Затем 1 × 106 клеток MCF-7 суспендировали в 100 мкл забуференного фосфатом солевом растворе, смешанном с матригелем (1: 1), и вводили в жировую подушечку молочной железы мыши. Через две недели после инъекции клеток мышей случайным образом разделяли на три группы, которые интраперитонеально вводили с контролем (0,1% раствор ДМСО) или с 20 и 50 мг / кг генистеина соответственно (растворяли в 0,1% растворе ДМСО) ежедневно в течение 2 недель. Опухоли измеряли с помощью суппорта, и объем был рассчитан:

Объем = 1/2 (ширина2 × длина)

Опухоли вырезали, взвешивали и замораживали при -80 ° С до обработки для выделения РНК и белка. Для гистологического исследования части опухолей фиксировали в 10% нейтрализованном буфером формалине, вставляли парафин и затем 4 мкм срезы окрашивали для иммуногистологического анализа.

Секции опухолей депарафинизировали в ксилоле и регидратировали с помощью градуированного этанола с последующим микроволновым нагреванием в течение 30 минут в 10 мМ буфере для цитрата натрия (рН 7,2); 0,3% раствор перекиси водорода использовали для блокирования активности эндогенных пероксидов. Первичные моноклональные антитела к изоформе альдегиддегидрогеназы 1 (ALDH1 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), человеческое SMO (Santa Cruz Biotechnology) и Gli1 (Santa Cruz Biotechnology) применялись при температуре 4 ° C в течение ночи. инкубировали с меченой пероксидазой хрена с антимышиной / кроличьим антителом (Maixin Bio) в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве хромогена и гематоксилина в качестве ядерного контраста использовали 3,3′-диаминобензидин. Секции дегидратировали, очищали, и смонтирован.

Для анализа вестерн-блоттинга 1 × 106 клеток, инкубированных с различными концентрациями генистеина в течение 48 часов, собирали и лизировали. Концентрацию белка определяли по методу Брэдфорда с бычьим сывороточным альбумином (Sigma-Aldrich). Каждый образец обрабатывали первичными антителами против Smo (Sigma-Aldrich) или против Gil1 (Santa Cruz, Inc.). Первичные анти-тела были обнаружены с помощью конъюгированного с пероксидазой хрена антитела (1: 2000, GE Healthcare). Сигналы были обнаружены с помощью усовершенствованной системы детектирования хемилюминесценции (Amersham Pharmacia Biotech).

Суммарную РНК экстрагировали из клеточных гранул, используя комплект Quick-Prep total-RNA Kit (Amersham Biosciences, Великобритания) в соответствии с инструкциями производителя. Каждый образец инкубировали в течение 48 часов с различными концентрациями генистеина. Обратную транскрипцию выполняли с использованием набора транскрипции Taq Man (Applied Biosystems). Для количественной цепной реакции обратной транскрипционной полимеразы в реальном времени применяли 1 мл генных праймеров с набором SYBR Green RT-PCR (QIAGEN, Valencia, CA, USA) в объеме реакции 20 мл. Относительные изменения количества транскриптов в каждом образце определяли путем нормализации с уровнями мРНК глицеральдегида 3-фосфатдегидрогеназы. Праймеры были разработаны как: ALDH1 (вперед, 5′-AATGGCATGATTCAGTGAGTGGC-3 ‘, обратный, 5′-GAGGAGTTTGCTCTGCTGGTTTG-3′), SMO (вперед, 5’-CTTTGTCATCGTGTACTACGCC-3 ‘; обратный, 5′-CGAGAGAGGCTGGTAGGTG-3′) , Gli1 (форвард, 5’-GAACCCTTGGAAGGTGATATGTC-3 ‘, реверс, 5′-GGCAGTCAGTTTCATACACAGAT-3′) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа (вперед, 5’-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3 ‘, обратная, 5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3’ ).