Антиген вируса лейкоза крс

ИНСТРУКЦИЯ
ПО ПРИМЕНЕНИЮ НАБОРА ДЛЯ СЕРОЛОГИЧЕСКОЙ
ДИАГНОСТИКИ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

(утверждена 7 мая 2010 г.
с изменениями от 21 июня 2011 г.)

I. ОБЩИЕ СВЕДЕНИЯ

1. Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота (КРС).

2. Состав набора.

Содержание ингредиента в единице упаковки

Количество единиц препарата в одном наборе, варианты

2. Разбавитель антигена ВЛ

3. Специфическая преципитирующая сыворотка - СПС

4. Отрицательная контрольная сыворотка - ОКС

5. Положительная контрольная сыворотка - ПКС

6. Слабоположительная контрольная сыворотка - СПКС

7. Положительная контрольная сыворотка с антителами к р-24 антигену - ВЛ-ПКСр24

8. Смесь солевая агаровая - ССА

9. Разбавитель ССА

Набор выпускают в четырех вариантах комплектации. Варианты I и III рассчитаны на проведение 1000 исследований, вариант II на 250 исследований, вариант IV рассчитан на 4000 исследований. Комплектация наборов по вариантам осуществляется по согласованию с потребителем.

3. Антиген вируса лейкоза - лиофилизированная гомогенная аморфная масса светло-коричневого цвета с красноватым оттенком. При добавлении разбавителя в объеме, соответствующем объему антигена до высушивания, содержимое флакона полностью растворяется в течение 10 мин без хлопьев и осадка и представляет собой опалесцирующую жидкость темно-красного цвета.

Специфическая преципитирующая сыворотка (СПС) - прозрачная слегка опалесцирующая жидкость светло-желтого цвета или с розоватым оттенком. Допускается наличие небольшого осадка белка, легко разбивающегося при встряхивании.

Разбавитель антигена вируса лейкоза КРС - прозрачная бесцветная жидкость без механических примесей.

Контрольные сыворотки: ОКС, ПКС, СПКС и ПКСр24 представляют собой прозрачные жидкости светло-желтого цвета или бесцветные, образующие пену при встряхивании.

Смесь солевая агаровая (ССА) представляет собой сухую смесь, содержащую два типа частичек: порошок агара и кристаллы хлористого натрия.

Разбавитель ССА - прозрачная бесцветная жидкость.

4. Антиген вируса лейкоза КРС и разбавитель антигена вируса лейкоза расфасовывают по 5 см 3 , а СПС - по 10 см 3 во флаконы вместимостью 10 см 3 . Смесь солевую агаровую и разбавитель смеси солевой агаровой расфасовывают соответственно по 18,6 г и по 20 см 3 во флаконы вместимостью 20 см 3 . Флаконы плотно закрывают резиновыми пробками и обкатывают алюминиевыми колпачками.

Контрольные сыворотки (ОКС, ПКС, СПКС и ПКСр24) расфасовывают по 0,5 см 3 во флаконы вместимостью 10 см 3 или в ампулы вместимостью 2 см 3 . Ампулы запаивают, флаконы укупоривают резиновыми пробками и обкатывают колпачками.

5. Маркированные флаконы устанавливают в маркированные картонные коробки с разделительными перегородками или любые другие, обеспечивающие их целостность.

Срок годности набора - 2 года с даты выпуска при соблюдении условий хранения.

Хранить набор в сухих, закрытых и темных помещениях при температуре от 2 до 8 °С.

Транспортируют набор всеми видами крытого транспорта в условиях, исключающих замораживание и перегрев выше 25 °С.

В каждую коробку вкладывают инструкцию по применению набора.

По истечении срока годности препарат не должен применяться.

II . ПРИНЦИП МЕТОДА

6. Принцип реакции иммунодиффузии заключается в том, что антигены и антитела, помещенные в лунки, диффундируют в геле агара и при взаимодействии образуют комплекс, который проявляется в виде линии преципитации.

III. ПОРЯДОК ПРИМЕНЕНИЯ

7. Набор для серологической диагностики лейкоза крупного рогатого скота применяется для исследования сывороток крови в реакции иммунодиффузии (РИД) в геле агара с целью выявления антител против гликопротеидного антигена вируса лейкоза (ВЛ) крупного рогатого скота.

8. Для постановки РИД необходимо смесь солевую агаровую, содержащуюся в одном флаконе, перенести в стеклянную колбу вместимостью 500 см 3 , прилить 20 см 3 разбавителя смеси солевой агаровой (содержимое одного флакона) и 180 см 3 дистиллированной воды (или воды очищенной). Колбу поставить на кипящую водяную баню и выдержать до полного расплавления агара. В каждую чашку Петри внести по 12,5 см 3 расплавленного агара. При комплектации наборов по IV варианту реакцию иммунодиффузии проводить в 1 %-ном агаровом геле, приготовленном на фосфатно-буферном растворе с pH 7,2 - 7,6. Чашки оставить в течение часа с приоткрытыми крышками. При помощи штампа сделать отверстия (лунки) в геле агара, не допуская отслоения геля от дна чашки.

9. В каждой чашке прорезать по 4 фигуры, каждая из которых состоит из 7 лунок (одна в центре, остальные 6 - по периферии). Диаметр каждой лунки 7 мм, расстояние между центральной и периферическими лунками - 3 мм. Образовавшиеся диски геля удалить из лунок канюлей, соединенной с вакуумным насосом (или любым другим способом).

10. Лиофилизированный антиген ВЛКРС во флаконе растворить в 5,0 см 3 соответствующего разбавителя (или 0,85 % раствор натрия хлорида). Антиген растворяется в течение 10 мин без хлопьев и осадка. Растворенный антиген вносят в центральные лунки каждой фигуры.

11. Заполнение периферических лунок СПС можно проводить по одной из схем, приведенных на рисунках 17 и 18. СПС вносят в две диаметрально расположенные периферические лунки (1-й вариант постановки РИД - рис. 17) или в 3 периферические лунки, расположенные через одну (2-й вариант постановки РИД - рис. 18). При выборе заполнения периферических лунок следует учитывать, что 2-й вариант расположения лунок облегчает выявление слабоположителных испытуемых сывороток, однако количество исследований одним и тем же объемом антигена сокращается на 25 % по сравнению с 1-м вариантом.

12. Чашки закрыть крышками и инкубировать при температуре (20 - 26) °С. Через 48 ч осуществить учет реакции.

13. При оценке результатов реакции с испытуемыми сыворотками прежде всего устанавливают специфичность образовавшихся линий преципитации. Специфической считают линию преципитации, которая образуется между лункой с испытуемой сывороткой и антигеном и плавно сливается с контрольной линией, т.е. идентична ей (рис. 19). Неспецифической считают линию преципитации, которая формируется между лунками с испытуемой сывороткой и антигеном, но не сливается с контрольной линией преципитации, а пересекает ее или упирается в нее, образуя иногда шпору (рис. 20) (реакция неидентичности).

В зависимости от наличия в испытуемых сыворотках специфических антител против вируса лейкоза крупного рогатого скота и формой образовавшихся линий преципитации реакцию оценивают как отрицательную или как положительную.

IV. МЕРЫ ЛИЧНОЙ ПРОФИЛАКТИКИ

14. Использование препарата не требует специальных мер предосторожности и не представляет опасности для здоровья человека.

15. Препарат следуют хранить в местах, не доступных для детей.

V. ПОРЯДОК ПРЕДЪЯВЛЕНИЯ РЕКЛАМАЦИЙ

При использовании таких серологических методов диагностики лейкоза КРС, как реакция иммунодиффузии (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА), наиболее часто выявляются протеины p24 и gp51 вируса лейкоза КРС, которые не имеют общих антигенных детерминант с мажорными внутренними белками других онковирусов животных типа С и Д [3, 8, 9]. Индикация антител к рецепторным и структурным белкам (p24 и gp51) вируса лейкоза КРС в настоящее время широко востребована практикой, однако не лишена недостатков. Применяемые способы диагностики ЭЛКРС не позволяют выявлять клинически здоровых животных-вирусоносителей, поэтому параллельно используют молекулярно - генетические методы для индикации специфического антигена, в том числе провируса лейкоза КРС. Данный подход дает возможность в процессе диагностических исследований решить проблемы как ложноположительных, так и ложноотрицательных реакций. Несмотря на разработку и серийное производство достаточно эффективных серологических и молекулярно - генетических препаратов, способных выявить инфицированных животных даже на ранних стадиях инфекционного процесса, до настоящего времени не изучены и не востребованы практикой низкомолекулярные белки, роль и значимость которых для диагностики, изменения морфологической картины крови и образования опухолей не определены.

Цель работы - сравнительный анализ эффективности использования в диагностических реакциях на лейкоз КРС коммерческих антигенов и нового вирусного антигена, выделенного из культуральной жидкости при культивировании СПЭВ, контаминированной онковирусами типа C и D.

Материалы и методы. В работе для изготовления вирусного антигена использовали перевиваемую линию клеток (ПЛК) - СПЭВ из коллекции ВНИИВВиМ, контаминированную онковирусами C и D, не имеющими антигенного родства с вирусом лейкоза КРС. Характеристика ПЛК представлена в таблице 1.

Посевная концентрация клеток составляла 80-100 тыс/мл, а в качестве ростовой питательной среды использовали среду 199 с 10% сыворотки крови КРС с добавлением пенициллина (100 ед/мл) и стрептомицина (100 мкг/мл). Культивирование онковирусов C и D осуществляли стационарным методом в пластиковых матрасах в течение 5-6 суток при температуре 36+0,5 0 С в анаэробных условиях.

Характеристика сублинии клеток СПЭВ

Московский НИИ вирусных препаратов

199-с 10% СК КРС с добавлением

Посевная концентрация клеток (тыс/мл)

Сроки образования монослоя (сут.)

0,02% раствор Версена

Прозрачные, мелкозернистые, эпителиоподобные клетки полигональной формы

Из надосадочной культуральной жидкости выделяли белковую фракцию, содержащую белки с молекулярной массой 75-82 кДа, которую использовали в качестве вирусного антигена. Контроль активности вируса лейкоза (ВЛ) КРС проводили постановкой реакции иммунодиффузии (РИД) и методом твердофазного конкурентного ИФА (ТК-ИФА).

Для постановки РИД в качестве исходного материала использовали культурную жидкость (КЖ) на 6 сутки культивирования вируса. Образцы КЖ для РИД концентрировали в 30 раз диализом через полупроницаемую мембрану против 50%-ного раствора ПЭГ-600. Активность концентрированных антигенов оценивали в РИД, в варианте определения титра вируса. В работе использовали также коммерческий набор компонентов РИД производства Курской биофабрики, включающий антигены ВЛ КРС (p24 и gp-51) и положительную сыворотку крови (СК), содержащую преципитирующие антитела к антигенам p24 и gp-51. Активность антигенов оценивали по последнему разведению стандартного компонента набора или полученного нами вирусного антигена, при котором происходило образование видимого преципитата с положительной СК и выражали в обратной величине разведения вируса или в log 2 . ТК-ИФА проводили с использованием тест-систем ТК-ИФА Курской биофабрики.

Новый вирусный антиген был использован также для постановки диагностической реакции на лейкоз КРС - определение инфицированности животных по способности их эритроцитов к агглютинации с вирусным антигеном. Предложенный способ диагностики ЭЛКРС включает в себя: отбор крови у; приготовление; Постановку реакции агглютинации эритроцитов (РАЭ) - 0,25-0,5% взвеси эритроцитов исследуемых КРС - с авторским вирусным антигеном проводили в серологических плашках в соотношении 5:1; инкубировали при температуре 4-8ºС в течение 12-15 часов; учет результатов проводили по характеру взаимодействия взвеси эритроцитов с антигеном. Положительной реакцией считали наличие осадка в виде зонтика с неровными краями по всей поверхности лунки; отрицательной - при наличии осадка в виде пуговки или точки на дне лунки.

Результаты и их обсуждение. Общепринятыми критериями оценки качества диагностических тест-систем являются высокая чувствительность, специфичность и воспроизводимость результатов контроля тестируемых показателей. С учетом этих критерий в наших исследованиях при разработке РА для диагностики лейкоза КРС оценивались в сравнительном аспекте характер и специфичность реакции взаимодействия цитратной крови, полученной от контрольных (здоровых) и инфицированных вирусом лейкоза животных, с антигеном, выделенным из культуральной жидкости СПЭВ, хронически инфицированной онковирусами типа С и Д.

Сравнительная оценка эффективности диагностики лейкоза КРС постановкой РАЭ с выделенным вирусным антигеном и стандартных тестов РИД, ИФА и ПЦР с кровью животных из неблагополучного хозяйства показала положительный результат во всех реакциях при обследовании 10 коров 3-х летнего возраста, инфицированных вирусом лейкоза КРС. При обследовании 10 голов клинически здоровых животных отрицательный результат был также во всех реакциях (табл. 2).

Сравнительная оценка результатов диагностики лейкоза КРС с использованием стандартных тестов РИД, ИФА и ПЦР и РАЕ с новым вирусным антигеном

Лейкоз крупного рогатого скота — хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, основным признаком которой является злокачественное разрастание клеток кроветворных органов с нарушением их созревания. В результате происходит диффузная инфильтрация органов этими клетками или появляются опухоли.

Болезнь регистрируется почти во всех странах мира и наносит значительный экономический ущерб. Особую актуальность она приобрела из-за близкого родства ее возбудителя с вирусом Т-клеточного лейкоза человека.

К вирусу восприимчивы крупный рогатый скот, овцы, зебу, буйволы и, по некоторым данным, лоси.

Характеристика возбудителя. Вирус относится к семейству Retroviridae, подсемейству Oncovirinae, роду Oncovirus. Вирионы сферической формы, размером 40—90 нм и состоят из нуклеотида (сердцевины) с кубическим типом симметрии и липопротеидной оболочки, образующей на поверхности выступы. Нуклеотид содержит диплоидный геном, представленный двумя односпиральными линейными молекулами РНК.

Устойчивость к физико-химическим воздействиям. Вирус неустойчив к факторам внешней среды. Инактивируется при высоких температурах (56 °С и выше), УФ-излучении, под действием ультразвука. Повторные размораживания и оттаивания разрушают вирус. Дезинфицирующие растворы (формальдегид, едкие щелочи, хлорная известь и т. д.) в обычных концентрациях действуют на него губительно. Вирус чувствителен к жирорастворителям (эфиру, хлороформу, ацетону и т. д.).

Антигенная структура и активность. Вирионы вируса содержат наружные гликопротеидные и внутренние полипептидные антигены. Гликопротеидные антигены обладают гемагглютинирующей активностью и индуцируют образование вируснейтрализующих антител, которые защищают животных от инфицирования. Полипептидные антигены индуцируют образование преципитирующих

и комплементсвязывающих антител. Кроме того, преципитирующие антитела синтезируются и к гликопротеидному антигену и обнаруживаются у инфицированных животных в более ранние сроки в РДП.

Антигенная вариабельность и родство. В антигенном отношении штаммы вируса лейкоза крупного рогатого скота родственны, но отличаются от ретровирусов и вирусов других родов по антигенным свойствам, морфогенезу, синцитиобразованию, образованию в монослойных культурах клеток, свойством ревертазы. На основании этих различий вирус лейкоза рекомендуют отнести к особой группе, именуемой как тип Е.

Культивирование вируса. В лабораторных условиях вирус размножается в краткосрочных субкультурах лейкоцитов крови и перевиваемых культурах клеток животных различных видов (крупного рогатого скота, овец, летучих мышей, обезьян, собак и т. д.) и человека. Наиболее чувствительны — монослойные культуры клеток селезенки на ранних пассажах.

Репродукция вируса в культуре клеток не вызывает нарушения монослоя, а сопровождается образованием многоядерных клеток (синцитиев) уже в ранних пассажах. Это свойство вируса (синцитиобразование) было использовано в диагностическом методе по выявлению инфекционного вируса и вируснейтрализующих антител.

Гемагглютинирующая активность. Вирус агглютинирует эритроциты мышей при pH 6,0 и 4 °С.

Экспериментальная инфекция. Ее можно воспроизвести на новорожденных телятах и овцах, которым инокулируют разными способами (внутриперитонеально, подкожно, внутримышечно, аэрозольно) нативные лейкоциты или краткосрочные культуры клеток от больных лейкозом коров, или вируссодержащую культуральную жидкость. После длительной инкубации (от нескольких месяцев до нескольких лет) развивается характерная клиническая картина лейко — и лимфоцитоза, которая заканчиваются опухолевой стадией болезни и гибелью.

При экспериментальном заражении коз, свиней, кроликов наблюдается длительное выявление вирусспецифических антител без клинических проявлений болезни.

Клинические признаки. Различают две формы клинического течения болезни: энзоотическую и спорадическую.

Энзоотический лейкоз поражает взрослых (5—8 лет) животных и протекает с длительным латентным периодом (до нескольких лет), который характеризуется стойким лимфолейкозом без клинических признаков болезни. Терминальная стадия сопровождается снижением массы тела, молочной продуктивности, увеличением лимфоузлов и заканчивается смертью. Экономический ущерб очень высокий.

Спорадический лейкоз встречается редко и в экономическом отношении малоактуален. Поражается молодняк до трех лет. Болезнь протекает в трех формах: ювенальной, тимусной и кожной.

Патологоанатомические изменения. Они специфичны и характеризуются диффузной инфильтрацией различных тканей клетками кроветворных органов и образованием опухолевых масс во внутренних органах (костном мозге, тимусе, селезенке, лимфоузлах, сердце, сычуге, почках, матке, скелетных мышцах). Лимфоузлы и селезенка увеличены, бугристые, с очагами некроза и кровоизлияниями.

Локализация вируса. Вирус локализуется в лимфоидных клетках разных органов, хотя обнаружить его удается только в молозиве и молоке. В инфицированных клетках естественно и экспериментально зараженных животных вирус сохраняется пожизненно (персистирует). В инфицированных лимфоцитах в форме провируса (непродуктивное состояние) вирус защищен от действия вируснейтрализующих антител и может передаваться потомству во время деления клеток. Провирус может изменять экспрессию генов клетки, что приводит к ее трансформации и развитию опухолевой стадии лейкоза.

Источник инфекции — больные животные. Основной путь передачи инфекции в естественных условиях через контаминированные вирусом инъекционные иглы, хирургические инструменты и т. д. при проведении санитарно-ветеринарных мероприятий. Кроме того, вирус может передаваться трансплацентарно (хромосомная или экстрахромосомная трансмиссия) от матери к плоду, алиментарно через молоко и молозиво, а также половым путем через инфицированную сперму. Распространяться инфекция может кровососущими насекомыми.

Диагностика. Диагноз на лейкоз ставят на основании эпизоотологических, клинических, патологоанатомических данных и результатов лабораторных исследований, которые играют решающее значение.

Взятие материала. От больных и подозрительных на лейкоз животных берут кровь. Для гематологических исследований ее берут из яремной вены с антикоагулянтом. Для серологических исследований используют сыворотку крови от животных в возрасте 6 мес и старше. Транспортируют в термосе со льдом.

От трупов берут кусочки пораженных органов: селезенки, лимфоузлов, грудной кости, печени, почек, легких, сердца, сычуга, матки, скелетных мышц. Транспортируют в свежем виде или в растворе консерванта (10%-ном формалине) в термосе со льдом.

Лабораторная диагностика. Проводят гематологические, гистологические и специфические исследования.

Гематологический метод основан на подсчете лейкоцитов периферической крови и выведении лейкоцитарной формулы. Для этого используют электронный счетчик или камеру Горяева. Из проб крови, где установлен лимфолейкоз, готовят мазки и подсчитывают клетки белой крови в зависимости от их морфологии.

У больных лейкозом повышено содержание лейкоцитов за счет клеток лимфоцитарного ряда, а также слабодифференцированных ретикулярных и антигенных (опухолевых) клеток.

У подозрительных на лейкоз животных гематологические исследования повторяют через равные интервалы (2—3 мес).

Для гистологических исследований из кусочков пораженных органов готовят специальные срезы и окрашивают гематоксилин-эозином. У больных лейкозом наблюдают диффузную инфильтрацию клетками лимфоидного ряда разной степени зрелости, склеротические изменения и некрозы.

Помимо этого для подтверждения диагноза могут проводить индикацию и идентификацию вируса.

Серодиагностика и ретроспективная диагностика. Используют серологические реакции, из которых наиболее чувствительны РДП и ИФА. Они позволяют обнаружить специфические антитела у инфицированных животных, начиная с 6-месячного возраста и старше. Это объясняется тем, что телята, выпаиваемые молозивом и молоком инфицированных коров, получают материнские антитела, которые сохраняются до 6 мес.

РДП (РИД). Для постановки реакции используют диагностический набор, содержащий необходимые компоненты (специфический антиген и сыворотку к нему, отрицательную сыворотку). Реакцию ставят микро — или макро методом по общепринятой методике, используя 0,8%-ный агар на трис-буфере. Учет проводят через 48 ч. Животные, сыворотки крови которых положительно прореагировали (полоса преципитации между испытуемой сывороткой и антигеном) в РДП, считаются зараженными лейкозом.

ИФА. Применяют для обнаружения специфических антител в сыворотках крови, молоке и молозиве. Используются диагностические наборы для непрямого и конкурентного вариантов ИФА. Данный метод в 100 раз чувствительнее РДП и позволяет проводить широкомасштабные исследования по эпизоотическому лейкозу в стадах крупного рогатого скота.

Другие серологические методы уступают по чувствительности (% выявляемости) РДП и ИФА, поэтому могут рекомендоваться в качестве дополнительных. К ним относятся реакции латексагглютинации (РЛА), непрямой гемагглютинации (РНГА), непрямой иммунодиффузии (РИФ), а также встречного иммуноэлектрофореза (ВИЭФ).

Индикация и идентификация вируса. В диагностике лейкоза крупного рогатого скота они имеют скорее дополнительное значение и используются менее широко. С этой целью применяют ПЦР для обнаружения вирусного генома (провирусной ДНК), выделение вируса в культуре клеток и его индикацию в месте синцитиобразования, электронно-микроскопический метод, реакции бласттрансформации лейкоцитов (РБТЛ), а также обнаружение вирусных антигенов методом радиоиммунологического анализа (РИА).

ПЦР. Реакция позволяет обнаружить провирусную ДНК в патологическом материале через две недели после заражения. В диагностический набор входят праймеры, соответствующие участкам определенных генов некоторых структурных белков. Чувствительность данного набора достаточно высокая и позволяет выявлять до десяти копий ДНК в 1 мкг исследуемой пробы.

Тест синцитиобразования (ТСО). Основан на выделении инфекционного вируса в субкультурах и перевиваемых культурах клеток лимфоцитов, где он размножается с образованием многоядерных клеток (синцитиев), которые выявляются при окрашивании монослоя.

Электронно-микроскопический метод. Позволяет обнаруживать вирусные частицы в препаратах, полученных из краткосрочных культур клеток лейкоцитов крови, зараженных вирусом лейкоза, и из перевиваемых культурах клеток, сокультивируемых с инфицированными лимфоцитами. Вирионы обнаруживают в основном в межклеточном пространстве и на внешней мембране лимфоидных клеток. Они имеют ультраструктуру, характерную для онковирусов типа С.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБТЛ). Основана на способности лимфоцитов трансформироваться в переходные клеточные формы в питательной среде (в присутствии фитогемагглютинина) при определенном режиме культивирования (36 °С, 72 ч). Такие же процессы происходят in vivo у клинически здоровых животных. В препаратах, полученных в результате культивирования и окрашенных по Романовскому—Гимзе, определяют количество трансформированных лимфоцитов на 1000 учтенных клеток и выражают показателем бласттрансформации. В норме у клинически здоровых коров он составляет в среднем 60 % (40—90 %). Диагноз на лейкоз считается подтвержденным, если этот показатель не выше 35 %.

РИА. Метод конкурентного радиоиммунного анализа позволяет обнаруживать вирусные антигены в краткосрочных культурах лимфоцитов крови инфицированных животных. Основан на конкуренции вирусного антигена, выделенного из зараженных клеток, с контрольным (специфическим) антигеном, меченным изотопом, за связывание со специфическими антителами. Метод — наиболее чувствителен и специфичен.

Дифференциальный диагноз. Лейкоз крупного рогатого скота дифференцируют от актиномикоза, туберкулеза, паратуберкулеза и бруцеллеза.

Иммунитет и специфическая профилактика. Вакцины против лейкоза крупного рогатого скота нет, но исследования в этой области продолжаются. В основном, они идут по двум направлениям: созданию вакцины на основании культурального вируса и разработки рекомбинантной вирусвакцины. Достижение первого направления исследований — получение культурального вируса с использованием перевиваемых культур клеток (LK-15, FLK и др.), выбор эффективного инактиванта (формальдегида, этиленимина и его производных), который обеспечивает сохранение антигенной активности и полностью устраняет инфекционность вируса, и, наконец, проведение испытаний опытных серий полученного препарата на естественно-воприимчивых животных (телятах).

Что касается генно-инженерных разработок, то на сегодняшний день в качестве вирусного вектора используют осповакцину, содержащую рекомбинантные гены, кодирующие наружные антигены вируса лейкоза. После адаптации таких штаммов к культурам клеток (NP-2) получена живая культуральная рекомбинантная вакцина, опытные серии которой испытаны на телятах и овцах.

Если вы нашли ошибку, пожалуйста, выделите фрагмент текста и нажмите Ctrl+Enter.

Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к способам получения антигена вируса лейкоза (ВЛКРС) для серологической и иммунохимической диагностики болезни. Способ состоит в осаждении циркулирующих иммунных комплексов (ЦИК) сыворотки крови больных лейкозом животных с последующей их диссоциацией и экстрагированием белковых компонентов ВЛКРС. Способ позволяет получать более специфичный и стабильный антиген ВЛКРС для серологической и иммунохимической диагностики лейкоза крупного рогатого скота. Преимуществом предлагаемого антигена является то, что он позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе и открывает новые перспективы для разработки новых более эффективных и информативных иммунохимических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

ВЛКРС обладает выраженной антигенной активностью. В организме крупного рогатого скота антитела вырабатываются преимущественно на структурные белки вириона. У зараженных животных в крови циркулируют антитела к р24, р15, р12, p10, gp30 и gp51. Хотя и считается, что диагностическое значение имеют антитела против gp51 и р24 ВЛКРС, в количественном соотношении они могут коррелировать со стадией инфекционного процесса [1]. Кроме того, доказано, что на разных стадиях развития иммунитета при лейкозе крупного рогатого скота меняется и спектр свободно циркулирующих в сыворотке крови антител, обнаруживаются антитела не только основным белкам вириона, но и продуктам их расщепления. Все эти данные свидетельствуют о необходимости комплексного подхода при определении как антигенов вируса, так и антител к ним в серологической диагностике лейкоза крупного рогатого скота. Необходимо также отметить, что существующие методы диагностики не учитывают генетического многообразия возбудителя болезни [2].

В настоящее время для изучения эпизоотической ситуации по инфекционным болезням в регионах и для их диагностики в мировой практике широко используются и разрабатываются различные экспресс тест-системы.

Наиболее значимыми в разработке экспресс-тестов для диагностики инфекционных болезней являются методы иммунохимического анализа. При этом применяются различные технологии, среди которых немало важную роль играют модифицированные методы ИФА, а также иммуноблот анализ. Определяющим фактором эффективности иммунохимических методов является качество используемого антигена. В настоящее время большинство серологических реакций, применяемых в диагностике лейкоза крупного рогатого скота, направлено только на выявление анти-gp51 антител.

Известные способы получения антигена ВЛКРС предусматривают культивирование вируссодержащих клеток с последующей их обработкой специальными методами. Патент на изобретение №2020960 от 15 октября 1994, патент на изобретение №2185854 от 27 июля 2002, патент на изобретение US 8529909 В2 от 27 сентября 2009. Известны способы получения антигена вируса лейкоза с использованием фазовых систем декстран - полиэтиленгликоль (ПЭГ), сульфат декстрана - ПЭГ, сульфат декстрана - поливиниловый спирт, сульфат декстрана - метилцеллюлоза [3].

Основным недостатком всех известных способов является то, что они трудоемки и позволяют получать антигены или р24, или gp51.

В предлагаемом изобретении при выделении антигена ВЛКРС из сывороток крови больных лейкозом коров исходили из того, что вирусные частицы, главным образом, содержатся в составе ЦИК. Технологию разрабатывали с учетом необходимости диссоциации ЦИК и избавления от сывороточных антител и всех остальных белков.

Предлагаемый способ осуществляется следующим образом.

1. Осаждение ЦИК в сыворотке крови методом преципитации полиэтиленгликолем (ПЭГ-6000). Для этого сыворотку крови от больных лейкозом коров в объеме не менее 500 мл смешивают раствором ПЭГ-6000 в 0,1 М боратном буфере (pH-8,8) до 3% конечной концентрации. Перемешивают и оставляют на 24 часа при +4°С.

2. Выделение ЦИК методом центрифугирования. По истечении указанного времени пробу сыворотки крови центрифугируют 10 мин при 3000 об/мин, надосадок сливают, а осадок растворяют в 5-кратном объеме 3% раствора ПЭГ-6000 в боратном буфере и вновь центрифугируют в тех же условиях (промывка).

3. Диссоциация ЦИК и удаление глобулинов. Полученный осадок, содержащий ЦИК с компонентами вируса, растворяют в 3-кратном объеме дистиллированной воды и выдерживают, периодически перемешивая, 1 час при 60°C. По истечении этого времени пробу смешивают равным объемом насыщенного раствора сульфата аммония, осторожно перемешивают в течение 2-3 минуты и центрифугируют.

4. Выделение и очищение антигенного препарата. Надосадочную жидкость осторожно отделяют и диализируют при комнатной температуре в течение 48 часов против дистиллированной воды. Фильтруют через бумажный фильтр и концентрируют (не менее в 10 раз) против силикагеля L 100/250 для хроматографии.

По результатам исследований установлено, что вирусные частицы, выделенные из сывороток крови больных лейкозом коров, обладают антигенными свойствами и не уступают по специфичности антигену gp51, применяемых в коммерческих наборах для ИФА.

Из приведенных в таблице данных особый интерес представляют результаты исследований проб №№3, 7 и 8. Показатели оптической плотности (ОП) в ИФА у этих проб с исследуемым антигеном гораздо выше. Причем результаты ОП положительной контрольной сыворотки у данного антигена ниже, чем у коммерческого набора.

Как известно, в тест-системах для диагностики лейкоза крупного рогатого скота в основном используются белки оболочки вируса - gp51. Положительные контрольные сыворотки, соответственно получены против этого антигена.

Полученные результаты свидетельствуют о том, что исследуемый антиген является комплексным, содержащим различные белковые фракции вируса лейкоза, и позволяет определять более полный спектр антител при инфекционном процессе, открывает новые перспективы для разработки новых более эффективных и информативных иммунохимических методов диагностики лейкоза крупного рогатого скота.

1. Сюрин В.Н. Вирус лейкоза крупного рогатого скота / В.Н. Сюрин, Р.В. Белоусова, Н.В. Фомина. - М.: МВА, 1998. - С. 76-85.

2. Хазипов Н.З. Генотипирование вируса лейкоза крупного рогатого скота по env-гену / Н.З. Хазипов, Р.Н. Вафин, А.М. Алимов и др. // Вестник Российской академии с/х наук. - 2011. С.62-63.

3. Hammar L., Merza М., Malm К., Eriksson S., Morein В. The use of aqueous two-phase systems to concentrate and purify bovine leukemia virus outer envelope protein gp51. / Biotechnology and biochemistry. - 1989. - 11. - 296-306.

Способ получения антигена вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС), включающий выделение белковых компонентов ВЛКРС из сыворотки крови, отличающийся тем, что предварительно осаждают циркулирующие иммунные комплексы (ЦИК) методом преципитации с ПЭГ-6000 с последующей диссоциацией путем инкубирования при 60°C 1 час, иммуноглобулины осаждают полунасыщенным раствором сульфата аммония, супернатант диализируют против дистиллированной воды, концентрируют против силикагеля L100/250 и используют в качестве антигена в иммунохимических реакциях в диагностике лейкоза крупного рогатого скота.