Пцр диагностика на онкологию в

Общеизвестно, что интенсивная цитостатическая терапия наряду с противоопу­холевым эффектом оказывает выраженное иммунодепрессивное действие. В связи с этим у больных необходимо регулярно контролировать наличие системных или локальных инфекций, прежде всего вирусной природы. Так, инфекция цитомегаловирусом или парвовирусом В19 может вызвать выраженное подавление гемопоэза. Вирус Эпштейна-Барр иногда сопутствует возникновению лимфом. Это осо­бенно важно при использовании препаратов, подавляющих иммунитет (например, циклоспорина) после пересадки костного мозга. Кроме того, после многократных трансфузий эритроцитов или тромбоцитов больных нужно периодически прове­рять на наличие вирусов гепатитов В и С в плазме крови.

Злокачественная трансформация клеток вызывается нарушениями в генах, отвечаю­щих за регуляцию их деления, дифференцировки и программированной гибели-апоптоза. Мутации генов - явление случайное, но селективный отбор мутантных клеток делает родоначальниками опухоли только те клетки, которые независимы от регуляторных сигналов организма. Для формирования злокачественности необходимо 6-14 генетических событий, хотя общее число мутаций в опухолевых клетках может состав­лять тысячи. Как правило, вся опухолевая масса является потомками одной клетки, по­этому и мутации передаются всем клеткам-потомкам.

Определение мутантных генов и их РНК продуктов составляет основу молекулярно-ге-нетической диагностики онкологических заболеваний. Молекулярно-генетические мето­ды онкодиагностики высокочувствительны (10 -15 -10- 18 г). Полимеразная цепная реакция (ПЦР) мутантных генов в ДНК плазмы крови часто позволяет выявить опухоль в док­линической стадии. Теоретические расчеты показывают, что таким путем может быть обнаружен опухолевый очаг размером до 0,01 см 3 .

Наибольшую практическую ценность в качестве молекулярно-генетических маркеров име­ют онкогены и антионкогены. Онкогены - дефектные гены факторов положительной регу­ляции клеточного деления (семейства ras, raf и myc-генов, семейства генов ростовых рецеп­торов) и генов антиапоптозных факторов, особенно bcl-2. Антионкогены или гены супрессоры опухолевого роста - гены факторов отрицательной регуляции клеточного деления, или гены факторов апоптоза. Дефект антионкогенов приводит к потере их противоопухолевой функции. Хотя известны десятки генов супрессоров опухолевого роста, наибольшее диагно­стическое значение имеют мутации гена белка р53 — ингибитора клеточного деления и клю­чевого фактора апоптоза, которые встречаются более чем в половине случаев онкологиче­ских заболеваний. Почти столь же распространены в опухолях дефекты гена супрессора опу­холевого роста белка р16. Молекулярно-генетический анализ онкогенов myc, ras, bcl-2 и ан-тионкогенов р53, АРС и р16 позволяет выявить большинство опухолей человека. Ранним и постоянным признаком малигнизации является развитие состояния генетиче­ской нестабильности, что вызывает мутации в микросателлитных ДНК - второй вид мо­лекулярно-генетических онкомаркеров.

Наконец, для опухолей характерно нарушение метилирования ДНК. Поэтому тр. видом молекулярно-генетических маркеров может быть анализ сайтов метилирования в опухолевой ДНК. Наиболее характерно гиперметилирование генов р 16, HIC, 14-3-30, АРС, GSTP1, E-cad, hMLHl, PTEN.

Поскольку опухоли имеют обычно моноклоновую природу, маркерные мутации присут­ствуют во всех опухолевых клетках, что позволяет обнаружить достаточное количество молекул мутантной ДНК при анализе, как самой опухоли, так и лимфатических узлов, крови, костного мозга, содержащих опухолевые клетки. Более того, мутантные молеку­лы ДНК опухолевого происхождения могуг быть выявлены даже в плазме крови онколо­гических больных.

Таким образом, для диагностики опухолей могут быть использованы три вида молеку­лярно-генетических маркеров. Однако, если для анализа онкомаркеров в ткани опухоли достаточно невысокой чувствительности, обнаружение их в лимфоузлах, костном мозге, крови и особенно плазме крови дребует особо высокой чувствительности, которую надежно обеспечивает только ПЦР.

Нам важно ваше мнение! Был ли полезен опубликованный материал? Да | Нет

Молекулярно-биологическое исследование крови на онкомаркеры можно пройти как в государственных клиниках, так и в частных медцентрах.

Результаты исследования уровня альфа-фетопротеина в сыворотке крови, как правило, готовы в течение 1–2 дней. Если необходим срочный анализ — в течение двух часов.

Молекулярно-биологическое исследование крови на онкомаркеры необходимо проводить натощак или через 4 часа после еды.

При подозрении на онкологическое заболевание рекомендуется пройти молекулярно-биологическое исследование крови на онкомаркеры.

Многие коммерческие лаборатории предлагают клиентам различные акции, скидки и программы лояльности.

Контроль качества лабораторных исследований, осуществляемый по международным стандартам, — дополнительная гарантия точности результатов анализов.

Рак — это заболевание, которое требует комплексного подхода к диагностике. Достоверно поставить такой диагноз можно только после комплекса исследований. Но заподозрить это заболевание помогут обычные анализы, которые легко пройти практически в любой лаборатории. Именно лабораторная диагностика помогает определить, с каким органом связаны возможные проблемы, и уже целенаправленно искать их причину.

Общий анализ крови: покажет ли он рак?

Интоксикация приводит к повышению СОЭ, увеличению количества нейтрофилов и снижению числа лимфоцитов. Если эти признаки сопровождаются слабостью, утомляемостью, потерей аппетита и похуданием, нужно как можно скорее исключить самый серьезный диагноз. Наиболее ярко такое сочетание признаков проявляется при некоторых формах лимфогранулематоза, при гистиоцитозе и нейробластомах [1] .

При опухолях внутренних органов часто страдает система кроветворения, снижается гемоглобин [2] . Токсическое действие продуктов жизнедеятельности опухолевых клеток повреждает мембраны эритроцитов, из-за чего в крови могут появляться их патологические формы — эхиноциты [3] . При раке костного мозга обнаруживают незрелые клетки крови.

Анализ крови при раке проводится так же, как и при любом другом заболевании. В процедурном кабинете у пациента забирают цельную кровь в специально подготовленную пробирку. Сдавать биоматериал нужно натощак или хотя бы через 4 часа после еды. Результат будет готов через 1–2 рабочих дня.

В анализе мочи при онкологии редко появляются специфические изменения. Но любые отклонения в результатах — это повод провести более тщательное обследование.

Кровь в моче является ранним симптомом рака мочевого пузыря или мочевыводящих путей. Но она также может появиться при мочекаменной болезни или гломерулонефрите.

Кетоновые тела говорят об усиленных процессах катаболизма, то есть распада тканей. Этот признак может появиться как при опухолевом процессе, так и, например, при сахарном диабете или во время диеты.

Для проведения анализа собирают утреннюю порцию мочи в стерильный контейнер. Перед тем как собрать материал, нужно принять душ, чтобы клетки с поверхности кожи не попали в контейнер.

Уже через 1–2 дня будет готов результат, с которым нужно обратиться к врачу. По одному анализу мочи поставить диагноз и даже заподозрить онкологию невозможно. Нужно учитывать другие результаты анализов и обследований, а также имеющиеся симптомы.

В биохимическом анализе крови для диагностики рака наиболее важны семь показателей [4] :

• Общий белок и альбумин. Опухоли активно потребляют белок, из-за этого его уровень в крови снижается. Плюс к этому часто теряется аппетит, строительный материал для клеток перестает поступать в организм в достаточном количестве. А если рак поражает печень, то производство белка в организме значительно снижается даже при нормальном питании.
• Мочевина. Повышение этого показателя в крови говорит об ухудшении функции почек или об активном распаде белка. Это может происходить как при опухолевой интоксикации, так и при распаде опухолевой ткани, в том числе при эффективном лечении рака.
• Изменение уровня сахара в крови может наблюдаться при саркомах, раке легких, печени, органов репродуктивной системы, других видах онкологии. Опухолевые клетки тормозят выработку инсулина, организм начинает несвоевременно реагировать на повышение концентрации глюкозы. В результате еще за несколько лет до первых клинических симптомов рака могут появиться признаки сахарного диабета. Особенно часто это происходит при раке молочной железы и матки. [5]
• Билирубин повышается при повреждении печени, в том числе при ее онкологическом поражении.
• АлАТ — фермент, который может повышаться как при опухолевом поражении печени, так и при других заболеваниях.
• Повышение щелочной фосфатазы — признак опухолей костной ткани, метастазов в костях, поражения печени, желчного пузыря основной опухолью или метастазами. [6]

Кровь для этого исследования забирают из вены. Желательно биоматериал сдавать утром до завтрака, иначе можно получить ложный результат. Это достаточно быстрый анализ и его результаты можно будет узнать уже через 1–2 дня.

Однако специфичность биохимического анализа также очень низкая. Изменения в анализе крови при онкологии не позволяют однозначно поставить диагноз. Скорее любые нарушения являются сигналом для врача провести более тщательную диагностику определенных систем или органов.

При онкологии значительно повышается свертываемость крови, возрастает риск возникновения тромбозов крупных сосудов и образования микротромбов в капиллярах.

Образование микротромбов в свою очередь ухудшает течение онкологического процесса. Круг замыкается. Были проведены серьезные исследования, которые показали, что применение препаратов, уменьшающих свертываемость крови, улучшает выживаемость онкологических больных даже при далеко зашедшем злокачественном процессе [8] .

Для выявления нарушений свертываемости исследуется коагулограмма. Для этого анализа также понадобится кровь из вены. А результаты будут готовы через 1–3 рабочих дня.

Анализ крови на маркеры раковых опухолей позволяет заподозрить онкологию на ранней стадии, оценить динамику заболевания, вовремя определить рецидив или появление новых метастазов, оценить эффективность лечения.

Онкомаркерами называют вещества, которые связаны с жизнедеятельностью опухоли и в организме здорового человека или не определяются совсем, или содержатся в очень малом количестве. Известно более 200 подобных веществ [9] . Но не все они одинаково успешно определяются в медицинской практике.

Для диагностики опухолей по анализу крови самые значимые маркеры — это α-фетопротеин и β-хорионический гонадотропин, которые определяются при некоторых видах опухолей яичника, тела и шейки матки. А также простатспецифический антиген PSA, который повышается при раке простаты.

Вторым по значимости следует СА-125, который выявляют при серозном раке яичников. Менее широко используют другие онкомаркеры:

• при опухолях молочной железы определяют РЭА, СА-15-3 и СА-72-4;
• при подозрении на рак шейки матки дополнительно к альфа-фетопротеину и ХГТ определяют SCC;
• при раке толстого кишечника — СЕА и СА-72-4;
• при подозрении на опухоль желудка — СЕА, СА-72-4 и СА-19-9;
• при подозрении на рак поджелудочной железы — СА-19-9 и СА-242;
• при раке щитовидной железы — hTERT, EMC1, TMPRSS4, галектин-3, EGFR, HBME-1;
• при раке мочевого пузыря в моче определяют ВТА, UBC, NMP-22 [11] .

Анализ крови на маркеры рака проводится натощак или через 4 часа после еды. Кровь забирают из вены. Анализ проводится в течение 1–2 рабочих дней. Если результат нужен срочно, его могут сделать за несколько часов.

Из всех методов лабораторной диагностики рака цитология обладает самой высокой специфичностью. С помощью цитологии можно практически всегда достоверно поставить диагноз и определить тип опухоли. Чувствительность этого метода зависит от вида рака и от того, насколько качественно взят материал для исследования. Например, если в промывные воды не попали раковые клетки, исследование даст отрицательный результат, хотя сама опухоль может развиваться.

При проведении исследования врач учитывает более 180 различных признаков атипии клеток. Такой анализ позволяет не только сказать, есть ли признаки онкологического процесса, но и определить источник опухоли, ее гистологический вариант, отличить первичную опухоль от метастаза [12] .

Цитологическое исследование проводят при опухолях практически любой локализации — кожи, легких, яичников, матки, лимфоузлов, костного мозга, печени, при любых подкожных образованиях.

Для исследования можно брать мазки-отпечатки с поверхности кожи или слизистых, мазки с шейки матки или из влагалища, мокроту, мочу, любое другое отделяемое. С целью исследования очагов, расположенных под поверхностью кожи, проводится пункция — материал забирают с помощью шприца с иглой. С помощью пункции можно забрать биоматериал из щитовидной железы, лимфатических узлов, костного мозга, участков печени, из любых других образований [13] .

Результаты цитологического исследования обычно выдаются через неделю после забора пробы. Бывают случаи, когда полученные препараты врачи показывают своим коллегам, сравнивают с архивом. Тогда исследование может затянуться до двух недель. Но в этом случае стоит подождать, ведь чем более тщательно проведено исследование, тем более точным будет результат.

Общий, биохимический анализ и коагулограмма не помогут выявить рак по одному анализу крови. Но с их помощью можно определить те органы, которые требуют особого внимания, и спланировать полноценное обследование. То же касается и анализа мочи.

Анализ крови на онкомаркеры может дать больше информации, связанной именно с возможностью развития раковой опухоли. Но и его нельзя рассматривать отдельно от общего состояния. Лучше проводить исследование сразу на несколько опухолевых маркеров, которые говорят об определенном виде рака, — это повысит достоверность диагностики.

Не стоит полагаться на какое-то одно исследование. Идеальный вариант для ранней диагностики рака — это регулярный профилактический осмотр, который включает в себя как анализы крови и мочи, так и ультразвуковое исследование, флюорографию, обследование молочных желез у женщин и посещение гинеколога или уролога.

• 1 Черенков В.Г. Клиническая онкология: учебное пособие для системы последипломного образования врачей/ В.Г. Черенков – Изд. 3-е, испр. и доп. – М.: МК, 2010. – С. 46.
• 2 Черенков В.Г. Клиническая онкология: учебное пособие для системы последипломного образования врачей/ В.Г. Черенков – Изд. 3-е, испр. и доп. – М.: МК, 2010. – С. 48.
• 3 Онкология: учебное пособие / Н. Н. Антоненкова [и др.]; под общ. Ред. И.В. Залуцкого. – Минск: Выш.шк., 2007 – С. 81.
• 4 Угляница К.Н. Общая онкология: учебное пособие / К.Н. Угляница, Н.Г. Луд, Н.К. Угляница – Гродно: ГрГМУ, 2007. – С. 318.
• 5 Черенков В.Г. Клиническая онкология: учебное пособие для системы последипломного образования врачей/ В.Г. Черенков – Изд. 3-е, испр. и доп. – М.: МК, 2010. – С. 48.
• 6 Онкология: учебное пособие / Н. Н. Антоненкова [и др.]; под общ. Ред. И.В. Залуцкого. – Минск: Выш.шк., 2007 – С. 83.
• 7 Франк М.И., Франк Е.М. Центральная гемодинамика, свертывающая и антисвертывающая система у больных со злокачественными заболеваниями желудочно-кишечного тракта / М.И.Франк // Тюменский медицинский журнал. 2010. №3–4. С. 94–95
• 8 Франк М.И., Франк Е.М. Центральная гемодинамика, свертывающая и антисвертывающая система у больных со злокачественными заболеваниями желудочно-кишечного тракта / М.И.Франк // Тюменский медицинский журнал. 2010. №3–4. С. 94–95
• 9 Онкология: учебное пособие / Н. Н. Антоненкова [и др.]; под общ. Ред. И.В. Залуцкого. – Минск: Выш.шк., 2007 – С. 108.
• 10 Урванцева И.А., Сафарян С.Л. Перспективы использования современных онкомаркеров в ранней диагностике почечно-клеточной карциномы / И.А.Урванцева // Синергия наук. 2017. №8. С. 557–561
• 11 Онкология: учебное пособие / Н. Н. Антоненкова [и др.]; под общ. Ред. И.В. Залуцкого. – Минск: Выш.шк., 2007 – С. 111–112.
• 12 Угляница К.Н. Общая онкология: учебное пособие / К.Н. Угляница, Н.Г. Луд, Н.К. Угляница – Гродно: ГрГМУ, 2007. – С. 375.
• 13 Угляница К.Н. Общая онкология: учебное пособие / К.Н. Угляница, Н.Г. Луд, Н.К. Угляница – Гродно: ГрГМУ, 2007. – С. 374–376.

Прак­ти­чес­ки лю­бой ана­лиз мо­жет дать лож­ный ре­зуль­тат: да­же если точ­ность ме­то­да близ­ка к 100%, мо­жет сыг­рать роль че­ло­ве­чес­кий фак­тор. По­это­му, по­лу­чив ре­зуль­та­ты ана­ли­зов в сво­ей кли­ни­ке, воз­мож­но, сто­ит пе­ре­ст­ра­хо­вать­ся и про­вес­ти кон­троль­ное ис­сле­до­ва­ние в дру­гой не­за­ви­си­мой ла­бо­ра­то­рии. Для под­тверж­де­ния ди­аг­но­за не­об­хо­ди­мо так­же прой­ти КТ или МРТ.

Из этого следует, что диагностика рака, любого размера, видимого глазом и с помощью приборов – это поздняя диагностика.

Ученые разных стран и нашей страны разными методами стремятся перейти к диагностике рака задолго до его симптомов. Именно на таком этапе болезни, можно надеяться на излечение от рака.

Нормальная клетка превращается в раковую после воздействия на нее какого-либо канцерогена. Это вызывает в ней изменения экспрессии генов, создающих ее свойства. Вторая причина – изменения экспрессии генов- супрессоров в этой клетке метилированием их промотора, а также мутации. Эти изменения происходят в генах, регулирующих процесс деления клетки, в генах, ингибирующих деление клетки при нарушениях в ее геноме, а также в генах, вызывающих апоптоз в таких клетках.

Каждый дефект в геноме раковой клетки является маркером такой клетки. Термин маркер (от англ. mark – метка). Диагностика первой раковой клетки и ее близких потомков по генам-маркерам – это ранняя диагностика рака у пациента.

Но как найти в организме пациента раковую клетку и ее потомки от первых делений среди 5 1013-14 клеток организма взрослого человека.

Как и любая клетка, раковая клетка микроскопического размера, возникнув в ткани, ничем не беспокоит пациента. За счет свойства к инвазии ее потомки распространяются в окружающие здоровые ткани и по всему организму, где, оседая, дают новые очаги рака – метастазы.

Но все изменил метод ПЦР, т.е. полимеразная цепная реакция, а в сочетании с ММК – методом молекулярных колоний, разработанным нашими учеными – чл.-корр. А.Б. Четвериным и Е.В. Четвериной (2002), стал для ранней диагностики весьма точным.

При любой локализации рака в кровь пациента попадают: а) сами раковые клетки – из стенок мозаичных капилляров узелка из раковых клеток в 1-2 мм в диаметре и б) гены-маркеры из погибших раковых клеток еще задолго до проявления как первичного очага рака, так и его метастазов. Это и позволяет выявлять рак у пациента с самого начала, т.е. с размера узелка в 1-2 мм в диаметре.

Еще в 60-70-х гг. XX в. Ф. Анкер (Ph. Anker) из Швейцарии сделал первые попытки доказать возможность обнаружения дефектных генов из раковых клеток в крови от пациента.

Наш ученый, проф. А.С. Белохвостов еще в 1960 г. XX в. обнаружил дефектные гены из раковых клеток яичника и желудка в асцитной жидкости. Он же с коллегами в 1978 г. XX в. доказал выход дефектных генов из раковых клеток в кровоток из опухолей в эксперименте на животных.

Теперь дефектные гены из раковых клеток обнаруживают с помощью ПЦР, а также ПЦР-ММК не только в крови, но и в других выделениях от пациента – слюна, слезная жидкость, слизь, мокрота, моча и др., в зависимости от типа раковой клетки.

Раковые клетки разрушаются в тканях за счет апоптоза как клетки с дефектами в геноме, а также при уничтожении Т-клетками.

Молекулы ДНК и иРНК не могут быть вне клетки, в частности, раковой клетки, а раковая клетка не может быть без ДНК и иРНК. Поэтому выявление этих молекул является эквивалентом обнаружения их носителя – раковой клетки.

Точно также по молекулам ДНК, РНК диагностируют бактерии и вирусы – возбудителей различных инфекций у пациентов.

Выявление генов-маркеров раковых клеток в их ДНК является идеальным методом для ранней диагностики раковых клеток, контроля лечения и излечения, а также предсказания и диагностики рецидива и метастаза рака у пациентов.

ПЦР-диагностика раковых клеток по плазме крови

Процесс, благодаря которому можно получать копии генов из ДНК в неограниченном количестве, называют полимеразной цепной реакцией – ПЦР.

ПЦР открыл в 1983 г. американский ученый К. Мюллис (Kary B. Mullis), за что он был удостоен Нобелевской премии.

Мишенями ПЦР являются – фрагмент ДНК с находящимся в нем геном и иРНК – копия гена.

Цель ПЦР – размножить фрагмент ДНК из образца плазмы крови пациента, т.е. получить его копии, а также размножить иРНК до уровня, детектиру- емого стандартными методами. Чтобы размножить иРНК, ее сначала нужно с помощью обратной транскриптазы перевести в комплементарную ей ДНК, т.е. кДНК.

Таким методом можно обнаружить экспрессию гена или генов по уровню их мРНК, а также мутации в гене, что явилось причиной превращения нормальной клетки в раковую.

Для ПЦР-метода из клинического образца – плазмы крови выделяют смесь всех содержащихся там ДНК и РНК. Далее, чтобы понять принцип копирования этих молекул, нам не обойтись без некоторых знаний об их природе.

Молекула ДНК состоит из двух цепей, построенных из нуклеотидов, основной частью которых являются азотистые основания: аденин – А, цитозин – Ц, гуанин – Г и тимин – Т. Азотистые основания несут в себе генетическую информацию о структуре белков, а через них – строение клетки и ее функции, а также ее воспроизведение, т.е. деление на две дочерние клетки.

По этому принципу цепи нуклеотидов составляют комплементарную пару: А одной цепи всегда против Т другой цепи, а Г против Ц. Когда А и Т в двух цепях ДНК расположены друг против друга, между ними образуются две водородные связи. То же происходит с Г и Ц, но между ними возникает три водородные связи.

Из комплементарности пар оснований следует, что последовательность или порядок размещения азотистых оснований на одной цепи ДНК, определяет порядок азотистых оснований в ее другой цепи. Концы цепей ДНК химически различны: у каждой цепи есть 3’-конец и 5’- конец (Рис. 1, 2, 3).

Фрагмент молекулы ДНК

Цепь ДНК, которая служит матрицей для синтеза матричной РНК называется матричной цепью.

Цепь мРНК – это копия матричной цепи ДНК

, последовательность азотистых оснований в ней та же, что и в нематричной цепи ДНК, но с заменой Т на У.

Цепь мРНК с помощью ПЦР размножают, но сначала ее с помощью обратной транскриптазы переводят в комплементарную ей матричную цепь ДНК – кДНК.

. кДНК синтезирована на матрице мРНК – копии гена

Образование водородных связей между парами оснований: А-Т и Г-Ц – это спонтанный процесс, т.е. без участия фермента. Эти связи слабые и легко рвутся при нагревании – цепи ДНК отделяются друг от друга, а при охлаждении раствора – вновь спариваются в прежнее комплементарное состояние. Спонтанный процесс образования пар оснований А-Т и Г-Ц называют гибридизацией.

В основе ПЦР-анализа и лежит гибридизация пар оснований, как спонтанный процесс.

Выделенные из образца плазмы крови ДНК и иРНК являются мишенями для ПЦР. Их смешивают с реакционным буфером и другими компонентами ПЦР в специальную пробирку и помещают в прибор – ДНК-амплификатор, дающий циклические изменения температуры реакции.

Цикл ПЦР для размножения молекул-мишеней – ДНК и иРНК состоит из трех стадий:

1) расплавление двухцепочечной ДНК путем повышения температуры реакционной среды до 90° С;

2) зная порядок оснований на концах фрагмента ДНК, взятого для размножения, т.е. амплификации, синтезируют химическим путем олигонуклеотиды, комплементарные этим участкам – это праймеры;

3) присоединение праймеров к матрицам, т.е. к однотяжевым цепям ДНК, полученными в результате первой стадии. Температура реакционной среды – 50-60°С.

На этой стадии происходит удлинение, т.е. элонгация гибридизованных праймеров ДНК-полимеразой при температуре для работы фермента 70-75°С, что превращает каждую из цепей в двухцепочечную молекулу ДНК (Рис. 4).

[рис. и цит. по: А.С. Белохвостов (1995) с изменения- ми]. На схеме цикл удвоения молекулы ДНК из исследуемого образца:

а – цепи исходной молекулы ДНК изображены двумя прямыми линиями;

б – после разделения цепей ДНК, к их концам присоединены по одному комплементарному праймеру в виде прямоугольника;

в – идет синтез новых цепочек ДНК.

Примечание. Стрелками показано направление синтеза новых цепей в

По окончании одного первого цикла из одной молекулы двухцепочечной ДНК получены две, в следующем цикле каждая из двух молекул снова удваивается и так далее, с нарастанием числа молекул (N) по формуле: N = 2n, где n – число циклов. Отсюда и название реакции – цепная.

Теоретически ПЦР позволяет размножить до легко детектируемых количеств даже единственною молекулу-мишень ДНК, даже если она находится среди множества других молекул ДНК и РНК. Стандартная ПЦР постоянно совершенствуется.

Продукты ПЦР – молекулы ДНК, а значит гены и иРНК подвергаются анализу рядом методов, например электрофорезом в геле с окраской молекулы ДНК бромидом этидия и др. Определяются ген(-ы) и мутации в них: замена – пара оснований меняется на другую; вставка – в молекулу введена новая пара оснований; делеция – отсутствие пары комплементарных оснований в гене. По количеству копий иРНК гена судят о степени его экспрессии в клетке.

Различают два варианта ПЦР-диагностики: 1) качественный тест и 2) количественный тест.

Для обнаружения раковой клетки в образце недостаточно, например, обнаружить иРНК, так как она может быть продуктом и нормальной, и раковой клетки.

Количественный тест определяет титр, т.е. число копий молекул- мишеней в определенном количестве образца, здесь крайне важны мишени – ДНК и иРНК.

Ведь для ранней диагностики рака крайне важно обнаружить его на самом раннем этапе – на уровне первой раковой клетки и ее первых потомков, а еще лучше на уровне предраковой клетки по генетическим маркерам в молекулах-мишенях – ДНК и иРНК. На уровне одной из этих клеток титр мишени будет минимальным.

Титр мишеней – ДНК и иРНК и их генетические маркеры необходимы:

1) для исследования молекулярных причин превращения нормальной клетки в раковую клетку в конкретном случае;

2) для слежения за течением скрытого еще рака на уровне первой раковой клетки и ее первых потомков, но также и для рака с симптомами;

3) для оценки эффективности лечения рака, коррекции лечения рака в процессе его лечения по состоянию генетических маркеров раковых клеток.

Чувствительность стандартной ПЦР разные авторы оценивают по- разному; причиной этого может быть и степень чувствительности ее в специфическом обнаружении молекул-мишеней, но и характер клинического образца – плазма крови, ткань опухоли, слюна, моча и другие различные выделения.

ПЦР-ММК-метод для ранней диагностики раковой клетки или клеток по плазме крови

Стандартная ПЦР может давать сбои и ошибки, в результате чего: 1) молекулы-мишени не будут выявлены из-за потери их в процессе подготовки образца;

2) молекулы-мишени могут быть не размножены в процессе ПЦР, тем более что в обычной клинической практике молекулы-мишени представляют незначительную долю среди ненужных матриц в образце.

Чл.-корр. А.Б. Четверин и Е.В. Четверина – сотрудники Института белка РАН – открыли метод молекулярных колоний – ММК, для прямого определения титра молекулы-мишени и пространственное разделение размножения нужных молекул-мишеней от ненужных. Этот метод запатентован учеными в РФ и в США (1995, 1998).

Принцип метода в том, что молекулы-мишени – ДНК и иРНК – размножаются не в жидкости, а в геле. Это создает отдельные колонии, каждая из которых является потомством единственной молекулы, т.е. клон.

ММК может сочетаться с ПЦР для размножения молекул-мишеней. Сначала гель полимеризуют, затем вымачивают в воде, чтобы удалить все растворимые вещества, затем автоклавируют и сушат.

Перед началом ПЦР гель пропитывают реакционной смесью. Этим авторы достигают полного сохранения активности ДНК-полимеразы и уничтожения молекул ДНК из окружающей среды, которые могли бы попасть в гель при его приготовлении. Синтез кДНК на молекуле иРНК может быть осуществлен отдельно или в геле. Для детекции мишеней используется универсальная реакционная смесь с ДНК-полимеразой (Рис. 5).

Схема проведения ПЦР-ММК

(рис. и цит. по: А.Б. Четверин, Е.В. Четверина, 2002).

1. а – лунка с высушенным полиакриламидным гелем;

2. б – пропитывание геля реакционным раствором, содержащим, в том числе, исследуемый образец и специфические праймеры;

3. в – инкубация геля в течение 30 мин при 55-65° С – условия обратной транскрипции, с последующими 40 циклами ПЦР;

4. г – промакивание геля нейлоновой мембраной – перенос колоний;

5. д – гибридизация мембраны с радиоактивно меченым зондом, специфичным к искомой мишени; получение радиоавтографа мембраны.

Основные отличия ПЦР-ММК от стандартной ПЦР

Для выполнения ПЦР-метода, а тем более ПЦР-ММК пригодны любая ткань, биологическая жидкость и выделения человека. По генным маркерам эти методы позволяют выявлять минимальное число раковых клеток при раке крови и лимфатической системы, так и при солидном раке. Это крайне важно для ранней диагностики раковых клеток первичного очага рака или метастазов, а также для выявления остатков раковых клеток после лечения рецидива рака.

Плазма крови от пациента является универсальным источником генных маркеров из раковых клеток любого типа клетки, т.е. любой локализации рака у пациента.

Повышение содержания генов-маркеров из раковых клеток в плазме крови при раке установлено многими исследователями.

- рак начинается из одной клетки, утратившей зависимость деления от защитных механизмов организма;

- в такой клетке возникают изменения генов, что вызывает бесконтрольное ее деление с образованием из нее клона клеток – рак;

- особенность лечения человека от рака в том, что эффект лечения возможен лишь до образования его метастазов;

- рак опасен из-за того, что отдельные его клетки отрываются от клона и, продолжая делиться, проникают в окружающие здоровые ткани, а другие образуют метастазы в отдаленных органах. Это причина гибели людей от рака;

- ПЦР позволяет в биологических жидкостях от больного выявлять самые начальные изменения в структуре ДНК клеток, а в сущности предрак;

- с помощью ПЦР удается в жидкостях обнаружить даже одну дефектную или мутантную молекулу ДНК из раковых клеток среди многих других молекул в исследуемой жидкости; чувствительность этого метода до 100%.

- ПЦР – это универсальный метод для ранней диагностики раковых клеток любой локализации рака у пациента. Им можно выявить тех лиц, которых необходимо обследовать детально.

Проф. А.С. Белохвостов (2000) впервые в двух работах изложил основы ранней диагностике раковых клеток с помощью ПЦР-метода; мы излагаем их кратко:

1) бессимптомный рост рака от одной клетки до очага в 2 мм в ткани продолжается долгие годы или даже десятилетия;

2) такой очаг из раковых клеток до 2 мм в диаметре дремлет в тканях до тех пор, пока не произойдут изменения в генах его клеток, вызывающих ангиогенез и лимфангиогенез. С этого момента начинается рост и распространение его клеток через кровь и лимфу по организму пациента – рак становится болезнью всего организма.

3) еще недавно диагностировать рак размером 2 мм, особенно если он находился во внутренних органах, было почти не возможным. И только метод ПЦР позволил определять очень малое число дефектных генов, иногда даже одну молекулу дефектного гена из раковой клетки.

Раковые клетки содержат эпимутации основных свойств и мутации или эпимутации генов-супрессоров. Такие изменения являются генетической меткой, т.е. маркером раковой клетки.

Ген k-ras – мутантная форма одного из ключевых нормальных генов стимуляторов деления клетки. Есть еще ряд генов с высокой частотой дефектов в раковой клетке. Для ранней диагностики раковой клетки важна регистрация эпимутаций и мутаций в нескольких генах.

В плазме крови у таких пациентов будут, пишет автор, находиться фрагменты ДНК из раковых клеток. Обнаружить их долго не удавалось, пока не появился ПЦР-метод.

По расчетам проф. А.С. Белохвостова и первый его опыт применения этого метода показал возможность диагностировать в любой ткани рак размером с 2-х мм в диаметре.

Автор подчеркивает, что диагностика раковых клеток в организме паци-по их генам-маркерам в плазме крови ПЦР-методом, позволяет осуществлять слежение за эффектом лечения рака. Он рекомендует сроки взятия для этого плазмы крови: до операции, после операции иссечения рака и путей лимфооттока, а также спустя не ранее, чем через 2 недели после лечения, и после химиотерапии.

Мы видим, что ученые сконцентрировали свое внимание на поиске в плазме и других биологических жидкостях генов-маркеров из ядер раковых клеток, а это нелегкая задача (В.П. Шелепов и соавт., 1997).

Оказалось, что мутации могут быть и в митохондриях – органеллах, расположенных в цитоплазме клетки и обнаружить их в раковых клетках достаточно просто. Это открытие сделано проф. Д. Сидрански (2000).

Гены, превращающие нормальную клетку в раковую клетку, часто находятся в ядре клетки в виде одной или многих копий. Но, оказалось, что дефекты и изменения могут возникать не только в них, но и в генах митохондрий раковой клетки.

В каждой клетке, в том числе и раковой, имеется несколько сот митохондрий. Митохондрии – это самореплицирующиеся органеллы.

В каждой из них есть своя ДНК, в ней несколько генов, обеспечивающих синтез белков митохондрий. Количество копий такой ДНК может быть от од-до десяти на митохондрию.

В результате мутации ряда генов митохондрий выявляются в более чем половине случаев раковой клетки разного типа.

Сейчас, пишет проф. А.С. Белохвостов, возможным пределом размера обнаруживаемого рака считается очаг в 2-3 мм в диаметре, то при применении ПЦР для поиска в плазме крови мутантных генов митохондриальной ДНК, из раковых клеток, по-видимому, можно будет определять очаг рака в ткани в 1 мм в диаметре.

В случае успеха такого подхода к оценке генов-маркеров раковых клеток ядерного генеза будут добавлены гены-маркеры из ДНК митохондрий раковых клеток.

Изменения в экспрессии генов свойств нормальной клетки – главная причина канцерогенеза.

Метилирование CpG-островков в промоторе гена выключает ген, а деметилирование – включает ген. При этом изменений структуры в последовательности оснований гена не происходит. Это обозначают термином – эпимутация, о чем мы уже писали в разделе канцерогенеза.

Метилирование или деметилирование промотора генов – это маркеры раковой клетки. Для анализа статуса метилирования генов раковой клетки часто используют МС-ПЦР – метилспецифическая полимеразная цепная реакция. Материалом для этого является ДНК раковых клеток в образцах плазмы крови и других биологических жидкостей, фрагменты из опухоли от пациента.

Диагностика раковых клеток по их эпигенетическим изменениям в сравнении с нормальной клеткой – это новое направление в ранней диагностике раковых клеток. Оно открывает новые пути для создания новых лекарственных средств и методов лечения от рака.