Стволовые клетки и саркома

В настоящее время это заболевание считается одним из самых злокачественных, сравнимым с меланомой и медуллобластомой. Оно поражает костную ткань, и, что особенно неприятно, развивается у детей, подростков, при этом рано дает метастазы. В некоторых случаях первичная опухоль вначале возникает не в костях, а в мягких тканях, и уже потом поражаются кости. Саркома Юинга развивается чаще всего с учетом наследственной предрасположенности, почти у половины пациентов была в анамнезе травма конечностей или ушибы костей.

Как проявляется саркома Юинга?

Чаще всего пациента начинает беспокоить слабая или нарастающая боль, например, в конечности, протекающая приступообразно, чередуясь с периодами усиления. Что вызывает особые страдания, так это тот факт, что в ночное время боль не ослабевает, несмотря на неподвижное положение конечности. Случается противоположное: при неподвижном положении конечности происходит усиление болевого синдрома.

Часто появляются воспалительные признаки: возникает отечность, гиперемия, чувство жара над опухолью. Рост опухоли сопровождается дилатацией (расширением) и усилением рисунка подкожной венозной сети.

Через несколько месяцев опухоль уже становится заметна невооруженным глазом, и ее можно вполне пропальпировать. Именно к этому периоду относятся первые признаки появления опухолевой интоксикации организма: запускается процесс, который и приведет к необходимости использовать в лечении стволовые клетки.

Клинически эта стадия напоминает инфекционный артрит (воспаление сустава) с общими проявлениями в виде слабости, лихорадки, потери веса и снижения аппетита.

В периферической крови возникают первые признаки влияния опухоли на кроветворение – выявляется анемия. При возникновении метастазов симптоматика значительно ухудшается в той части, которая говорит о параканкрозных (находящихся рядом с опухолью) процессах.

В результате при этой разновидности саркомы, как и при многих других злокачественных новообразованиях, поражается костный мозг, в том числе стволовые клетки мозга. Что особенно неблагоприятно, так это то, что костный мозг страдает на значительном отдалении от опухоли.

Так, новообразование может поражать большеберцовую кость, а поражение костного мозга будет встречаться и в подвздошных костях таза, и в грудине. Ведь красный костный мозг находится только в плоских костях, например в ребрах. Для оценки этой паранеопластической анемии применяется исследование костного мозга, выполненное с помощью биопсии.

Зачем нужны стволовые клетки

Использование стволовых клеток, взятых у пациента в детстве и помещенных своевременно в банк стволовых клеток молочных зубов, могут существенно ускорить регенерацию костного мозга. Еще более высокой активностью обладают стволовые клетки организма, взятые у пациента при родах. Использование пуповинной крови позволяет извлечь из нее стволовые клетки и тоже хранить их до использования в случае необходимости.

Согласно данным официальной статистики, применение аутогенных (собственных) стволовых клеток позволяло вообще обойтись без отторжения тканей, что часто встречается при аллотрансплантации костного мозга. При этом не нужно дополнительно назначать иммунносупрессивные препараты для того, чтобы костный мозг не отторгнул элементы после пересадки стволовых клеток – ведь использовались собственные, а не донорские клетки.

Именно поэтому трансплантация стволовых клеток, взятых из собственного организма пациента в раннем детстве или при родах, позволяет добиться 100-процентной приживаемости и регенерации костного мозга. Это дает возможность организму победить даже такую тяжелую болезнь, как саркому Юинга.

Аннотация

Значение контаминации опухолевыми клетками в костном мозге и стволовых клетках периферической крови (PBSC) пациентов с солидными опухолями остается спорным. Для очистки опухолевых клеток от продуктов аутологичных стволовых клеток были разработаны различные методы, включая селекцию CD34 + . Сборы PBSC от пациентов с опухолями семейства Юинга (EFT) анализировали на загрязнение опухолевых клеток до и после отбора CD34 + с использованием анализа с обратной транскрипционно-полимеразной цепной реакцией (RT-PCR) и проточной цитометрией (FC). Экспрессия CD34 изучалась с помощью ОТ-ПЦР и ФК в 14 первичных опухолях и 13 сборах PBSC соответственно. Опухолевые клетки были идентифицированы в урожаях обоими способами. У двух пациентов загрязняющие опухолевые клетки были обнаружены с помощью ОТ-ПЦР только после положительного отбора. ФК анализ подтвердил более высокий уровень опухолевых клеток во фракции CD34 + . В попытке исследовать это открытие, экспрессия CD34 была обнаружена в 93% первичных опухолей и 67% загрязненных урожаев. Поскольку CD34 экспрессируется на клетках EFT, эти клетки могут быть обогащены после отбора урожаев CD34 + , хотя общее количество опухолевых клеток уменьшается. Другие методы очистки, а не отбор CD34 + , должны быть изучены у пациентов с EFT, подвергающихся аутологичной трансплантации стволовых клеток.

Вступление

Основной причиной неудачи лечения у пациентов, перенесших трансплантацию стволовых клеток от злокачественных новообразований, является рецидив заболевания. Загрязненные стволовые клетки были предложены в качестве одной из возможных причин, приводящих к рецидиву.

Во многих исследованиях сообщалось, что опухолевые клетки присутствуют в сборах костного мозга и мобилизованных коллекциях стволовых клеток периферической крови (PBSC) от пациентов с различными злокачественными новообразованиями. Значение контаминации опухолевыми клетками аутотрансплантатов остается спорным, несмотря на то, что для ряда злокачественных новообразований было показано более короткое выживание без прогрессирования. 1

Были разработаны методы очистки опухолевых клеток от продуктов аутологичных стволовых клеток. Одним из методов является положительный отбор CD34-экспрессирующих клеток. 2

Восо и соавт. 3 пришли к выводу, что иммуномагнитный отбор клеток CD34 + обеспечивает аутотрансплантаты с уменьшенными опухолевыми клетками и способностью к приживлению, сходные с таковыми у неуправляемых аутотрансплантатов, на основе 29, 39 и 34 пациентов с неходжкинской лимфомой, множественной миеломой и раком молочной железы, соответственно. Однако в проспективном рандомизированном исследовании выживаемость без прогрессирования заболевания у пациентов с раком молочной железы высокого риска была одинаковой как в чистых, так и в чистых руках. 4

Влияние селекции CD34 + на количество загрязняющих клеток было проверено на нейробластомах и пациентах с множественной миеломой. 5, 6, 7, 8 Пятьдесят шесть процентов (9/16) коллекций PBSC оставались положительными по полимеразной цепной реакции (ПЦР) для экспрессии тирозингидроксилазы у пациентов с нейробластомой 4 стадии после положительного отбора с анти-CD34, но абсолютное количество количество реинфузированных опухолевых клеток уменьшилось. 6 Несмотря на то, что в выбранной группе PBSC из множества пациентов с миеломой наблюдалось уменьшение нагрузки на опухолевые клетки в среднем на 3, 1 log, не было различий в частоте ответа и выживаемости без прогрессирования между двумя группами, получавшими выбранный CD34 + или невыбранные продукты PBSC. 7, 8

Саркома Юинга (ES) является второй наиболее распространенной первичной злокачественной опухолью костей у детей и подростков и относится к группе нейроэктодермальных опухолей, известных как семейство опухолей ES (EFT). 9 Все EFT имеют одну из следующих специфических транслокаций t (11; 22), t (21; 22), t (7; 22), t (17; 22) и t (2; 22). 10, 11, 12, 13, 14 Эти транслокации приводят к слиянию гена EWS в 22q12 с различными генами семейства транскрипции ETS, FLI-1 (85–90%), ERG (5–10%), ETV-1 , E1AF (1%) и редко FEV . Различные перестройки EWS, по- видимому, являются основными событиями в онкогенезе EFT, и эти генетические изменения считаются отличительными диагностическими признаками этих опухолей. 19

Мы и другие ранее изучали контаминацию опухоли при сборе PBSC от пациентов с EFT и выявили высокую частоту контаминации. 15, 16, 17, 18, 19 Toretsky et al. 15 идентифицировали химерный транскрипт в коллекциях клеток-предшественников крови всех пяти исследованных пациентов с EFT. Leung et al. 16 исследовали пять пациентов с EFT высокого риска, и все были положительными при обратной транскрипции (RT) -PCR, как в костном мозге, так и в трансплантатах крови. По крайней мере, один положительный набор был выявлен у одного из девяти и 10 из 15 пациентов с EFT высокого риска. 17, 18 В нашем предыдущем исследовании зараженные опухолью урожаи были обнаружены с помощью ОТ-ПЦР у всех 11 пациентов, по крайней мере, в одной из коллекций. 19

В этом исследовании мы исследовали контаминацию опухолевых клеток в урожаях от пациентов с EFT до и после отбора CD34 + с помощью RT-PCR и анализа с помощью проточной цитометрии (FC) и изучали первичные опухолевые клетки для экспрессии мРНК CD34 с помощью RT-PCR.

материалы и методы

Пациенты

Образцы (опухоли и / или урожаи) были получены от 26 пациентов с диагнозом EFT и получивших лечение в отделении детской гематологической онкологии Детского медицинского центра Израиля Шнайдер. Информированное согласие было получено от пациентов или их опекунов, и местный и национальный комитеты по этике одобрили исследовательский проект. Диагноз был подтвержден патологией, иммуногистохимией и молекулярным анализом, и все опухоли содержали химерный транскрипт EWS-FLI-1. Метастатическое заболевание при постановке диагноза присутствовало у пяти пациентов, и у 18 прогрессировало. У семи пациентов таз был основным участком. Сорок три процента (9/21) пациентов были плохими респондерами, определяемыми как некроз + проводили на урожаях от четырех пациентов (№ 1–4 во всех таблицах). Во время сбора урожая два пациента были в частичном ответе и два в полной ремиссии.

лечение

Первичное лечение состояло из химиотерапии в соответствии с протоколами VACA или IV-VACA (винкристин, актиномицин-D, циклофосфамид, адриамицин, ифосфамид, этопозид), хирургического вмешательства и лучевой терапии. Когда была достигнута полная ремиссия или очень хорошая частичная ремиссия, пациенты проходили сбор стволовых клеток после мобилизации G-CSF с последующим кондиционированием мелфаланом этопозидом и карбоплатином или бусульфаном и мелфаланом и реинфузией аутологичных стволовых клеток.

CD34 + выбор

Лейкаферез выполняли на сепараторе клеток крови с непрерывным потоком (Cobe Spectra, Lakewood, CO, USA). Выбор CD34 + проводили с использованием устройства CliniMACS (Miltenyi Biotech, Bergisch Gladbach, Германия) в соответствии с инструкциями производителя. После надлежащей маркировки и промывания клеток отбирали образец 200 мкл для подсчета клеток, определения CD34 и анализа RT-PCR химерного транскрипта. Мешок с клетками прикрепляли к фильтру микроагрегата и загружали в колонку cliniMACS с магнитным разделением с высоким градиентом. Из положительно выбранной фракции был взят образец для подсчета клеток, жизнеспособности, определения CD34, анализа ОТ-ПЦР для химерного транскрипта и анализа ФК. Образец из отрицательной фракции также анализировали для обнаружения химерного транскрипта с помощью ОТ-ПЦР и для анализа ФК. Процент CD34 + клеток во фракции CD34 + составил: 82, 5, 91, 8, 93 и 86, 5 у пациентов нет. 1–4 соответственно.

ОТ-ПЦР

Тотальную РНК выделяли из биопсий или сборов с TRI-реагентом (MRC, Цинциннати, Огайо, США). ОТ-ПЦР проводили с использованием системы Access RT-PCR (Promega, Madison, WI, USA) в соответствии с инструкциями с 1 мкг общей РНК, 2, 5 мкМ магния, случайными гексамерами и ранее описанными праймерами 22, 8 + 22, 4 10, 21 для нормальный ген EWS и 22, 8 с Fli 11 22 для транскрипта слияния EWS – FLI-1. Вложенную ПЦР проводили с праймерами 22, 3 с Fli 3 22 после того, как кДНК разводили 1:50. Температуры отжига и удлинения составляли соответственно 69 и 72 ° C для транскрипта FLI-1. Для экспрессии CD34 , праймеры, описанные Hafer et al. 23 были использованы с температурами отжига и удлинения 68 и 72 ° C, соответственно. Качество РНК было проверено в дополнительном RT-ПЦР-анализе гена АТМ (данные не показаны).

Анализ ФК

Образцы из урожая и фракций CD34 + и CD34 - инкубировали с комбинацией четырех цветных антител: CD99 флуоресцеин-изотиоцианатного клона TU12, CD45 PerCP-клона HI30 (BD Pharmingen, Сан-Диего, Калифорния, США) и CD117 PE-клона MIB-1 ( Дако, Карпинтерия, Калифорния, США). 24 Образцы анализировали с помощью проточного цитометра FACS Calibur с использованием программного обеспечения CellQuest-Pro для сбора и анализа (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, BD Biosciences, Сан-Хосе, Калифорния, США). Контролируемые по изотипу контрольные моноклональные антитела были использованы для определения неспецифического связывания. Всего было собрано 300 000 событий на пробирку для достижения чувствительности одной опухолевой клетки на 10000 ядросодержащих клеток. Дополнительные 13 урожаев анализировали одновременно на загрязнение клеток Юинга и на экспрессию CD34 с использованием CD34 PerCP-клона 8G12 (Becton Dickinson Immunocytometry Systems).

Анализ проводился на живых клетках (для предотвращения ложной позитивности или негативности), но окончательные результаты представляли процент положительных клеток в общем количестве приобретенных событий.

Результаты

Идентификация клеток EFT в урожаях до и после отбора CD34 +

Сборы PBSC от четырех пациентов с EFT (№ 1–4) до и после отбора CD34 + анализировали на скрытые опухолевые клетки с помощью ОТ-ПЦР и вложенной ПЦР для специфического химерного транскрипта EWS-FLI-1. Необработанные урожаи от двух пациентов были ОТ-ПЦР-положительными и два отрицательными. Интересно, что все фракции CD34 + были ОТ-ПЦР-положительными. Основываясь на этих результатах, загрязняющие опухолевые клетки присутствуют после отбора CD34 + . Кроме того, неотобранные урожаи от двух пациентов, которые были ОТ-ПЦР-отрицательными, стали ОТ-ПЦР-положительными после процедуры положительного отбора во фракции CD34 + (рис. 1).

Экспрессия EWS / FLI-1 в урожаях, положительная и отрицательная фракции после отбора CD34 + у пациента №. 1. полоса 1: маркер; дорожки 2–3: положительный и отрицательный контроль для химерного транскрипта EWS / FLI-1; дорожки 4–7: образцы из двух последовательных сборов (4 и 5), CD34 + отбор (6) и отрицательная фракция (7); полоса 8: нет РНК.

Изображение в полном размере

Чтобы подтвердить эти результаты, имеющиеся сборы PBSC от пациентов № 1-3 до и после отбора CD34 + были проанализированы с помощью FC для выявления опухолевых клеток EFT путем выбора комбинации CD99 + / CD117 +/- / CD45. - (результаты приведены в таблице 1 и на рисунке 2). В обоих случаях клетки EFT могут быть идентифицированы в урожае до отбора CD34 + и в отрицательной, и в положительной фракциях. Процент EFT-клеток был повышен после отбора CD34 + у пациента в нет. 1 от 0, 11 до 0, 95 и у пациента нет. 3 от 0, 03 до 2, 01, даже несмотря на то, что общее количество опухолевых клеток было уменьшено в процессе отбора примерно на 75%. Эти результаты подтверждают результаты, полученные с помощью ОТ-ПЦР для химерного транскрипта.

Таблица в натуральную величину

ФК анализ для выявления клеток EFT в урожаях до и после отбора CD34 + . Сбор урожая до и после отбора CD34 у пациента №. 1 были проанализированы с комбинацией CD99 + / CD117 + / - CD45 - для обнаружения загрязнения EFT. Процент клеток EFT составляет: 0, 11, 0, 95 и 0, 01 в урожае ( а ), CD34 + отобранная фракция ( b ) и CD34 - фракция ( с ), соответственно.

Изображение в полном размере

Экспрессия CD34 в первичных опухолях и урожаях ES

Основываясь на наших результатах идентификации EFT-клеток во фракции CD34 + , мы хотели оценить, экспрессируют ли EFT-клетки CD34, используя два метода, а именно: проводили RT-PCR 14 опухолей для оценки уровня РНК и анализа FC 13 дополнительных сборов. образцы (так как не было свежих жизнеспособных опухолей) для оценки уровня белка.

Экспрессия CD34 была обнаружена в 13 из 14 опухолей (93%) при диагностике с использованием ОТ-ПЦР (рис. 3).

Экспрессия CD34 в первичных опухолях ES. Экспрессию CD34 определяли методом RT-PCR в первичных опухолях ES. Дорожки 1–4: первичные опухоли ЭС; полоса 5: нет РНК; полоса 6: маркер.

Изображение в полном размере

Анализ ФК проводился в два этапа. Сначала были идентифицированы EFT-клетки, а затем эти клетки были оценены на экспрессию CD34 на клеточной поверхности. Результаты суммированы в Таблице 2. Двенадцать из 13 (92%) урожаев были загрязнены EFT-клетками в процентах от 0, 02 до 0, 51. Экспрессия CD34 была очевидна в восьми из этих 12 (67%) урожаев, в пределах от 8 до 97 процентов. Не было никакой корреляции между количеством экспрессии CD34 и количеством клеток EFT (Таблица 2).

Таблица в натуральную величину

Клиническая корреляция с экспрессией CD34

Экспрессию CD34 оценивали в 14 опухолях и 13 сборах. У одного пациента были проанализированы как опухоли, так и образцы урожая (№ 14 и 22 в таблице 3 соответственно). Опухолевые клетки не были очевидны при сборе, и CD34 не мог быть обнаружен. В целом, большинство образцов (21 из 26; 81%) экспрессировали CD34. Не было выявлено никакой связи между экспрессией CD34 и клиническими признаками; возраст (определяется как выше или ниже 12 лет), первичный сайт (таз против других) и процент некроза (выше и ниже 90%).

Таблица в натуральную величину

обсуждение

Было разработано множество способов очистки продуктов стволовых клеток от опухолевых клеток. Одним из наиболее распространенных подходов является положительный отбор, при котором стволовые и прогениторные клетки очищаются от урожая. Это выполняется, главным образом, как положительный отбор на антиген CD34, приводящий к истощению CD34 - клеток и возможному заражению опухолевых клеток. Тем не менее, в нескольких исследованиях было обнаружено загрязнение опухолевых клеток после отбора CD34 + , хотя в некоторых случаях количество опухолей уменьшилось. 5, 6, 7, 8 В этом исследовании мы продемонстрировали, что опухолевые клетки Юинга присутствуют в урожаях даже после отбора CD34 + . Кроме того, у двух пациентов контаминирующие опухолевые клетки были обнаружены с помощью ОТ-ПЦР только после положительного отбора. Этот результат был подтвержден анализом FC, в котором у обоих пациентов процент опухолевых клеток был намного выше во фракции CD34 + , хотя общее количество EFT-клеток было снижено примерно на 75%. Точно так же, Донован и соавт. 25 выявили опухолевые клетки с помощью количественной ОТ-ПЦР для гена GAGE ​​после отбора CD34 + (с наблюдаемым снижением опухолевой нагрузки на 2–4 log) в урожаях от пациентов с нейробластомой, и они также показали один образец, который был ОТ-ПЦР-отрицательным до отбора и оказалось положительным после отбора, что указывает на увеличение количества загрязняющих опухолевых клеток.

Эти наблюдения ставят вопрос о том, экспрессируют ли опухолевые клетки также антиген CD34 на своей поверхности и, таким образом, они захватываются и обогащаются после процесса отбора CD34. Эта проблема была решена в различных опухолях, подтверждая экспрессию CD34 в солидных опухолях. 23, 26, 27, 28 Экспрессия CD34 была подтверждена несколькими методами: анализ ФК, вестерн-блоттинг и уровень мРНК в клеточных линиях нейробластомы. 23, 26 Восемь из 16 клеточных линий имели положительную экспрессию мРНК CD34, и все, кроме одной клеточной линии, были положительными по меньшей мере для одного клона для более чем 20% культивируемых клеток с панелью из пяти различных клонов антител против CD34. 23, 26. Экспрессию CD34 анализировали иммуногистохимическим методом на 11 фиксированных формалином опухолях, окруженных парафином, в злокачественных оболочках периферических нервов, и в двух из них CD34 был положительным. 27 Обнаружено, что две линии клеток мелкоклеточного рака легкого оказались положительными в отношении CD34, проанализированного с помощью FC, и экспрессия была подтверждена с помощью RT-PCR. 28 Это говорит о том, что следует соблюдать осторожность, используя PBSC, положительно выбранный для CD34 + от пациентов с этими солидными опухолями. 23, 26, 27, 28

Мы рассмотрели эту проблему в первичных опухолевых клетках ES и выявили экспрессию мРНК CD34 в 13 из 14 протестированных опухолей (93%). Экспрессия белка CD34 была очевидна с помощью анализа ФК в 67% урожаев. Учитывая эти результаты, мы также предлагаем, чтобы опухолевые клетки были проверены на экспрессию CD34, прежде чем рассматривать выбор CD34 + у пациентов с EFT. Другая проверка результатов, продемонстрированных в этом исследовании, была получена в нашем исследовании профилирования экспрессии генов в ES с использованием Affymetrix oligonucleotide U95Av2. CD34 (инвентарный номер M81945) был выражен в 14 первичных опухолях и шести метастазах, полученных от 18 пациентов с EFT. 29 Мы не смогли обнаружить какую-либо корреляцию между экспрессией CD34 и известными клиническими прогностическими параметрами в EFT.

Поскольку отбор CD34 + не достигает уровня даже 1 log-истощения опухолевых клеток у пациентов с ES-экспрессирующим CD34, для очистки необходимо использовать альтернативный метод, например, с использованием моноклонального антитела 8H9, как продемонстрировано Мерино и соавт. 30 Это антитело связывается с ES-клетками, а не с нормальными гематопоэтическими клетками, и они показали снижение содержания загрязняющих клеток на 2–3 log. Другая возможность - добавить шаг отрицательного выбора после положительного выбора. Высокая эффективность очистки более пяти журналов была достигнута путем сочетания как положительного (по CD34 + ), так и отрицательного (по анти-CD19 / 20/23/37) отбора при В-клеточной хронической лимфоцитарной лейкемии и В-клеточной неходжкинской лимфоме, 31, 32

В заключение, мы продемонстрировали экспрессию CD34 в опухолевых клетках ES и возможное увеличение процентного содержания этих клеток после отбора CD34 + PBSC урожаев, хотя общее количество загрязняющих клеток снижается до некоторой степени. Вследствие этих результатов, клиническая значимость альтернативных методов очистки PBSC пациентов с EFT должна быть изучена.

Статьи

При делении стволовые клетки, являющиеся незрелыми, могут формировать подобные себе клетки в большем количестве, вследствие чего и возникли вопросы относительно связи, провоцируют ли стволовые клетки и рак. Если человек заболевает или получает травму, клетки организма погибают или повреждаются. Стволовые клетки активируются, чтобы заменить погибшие или старые, восстановить поврежденные ткани и предотвратить преждевременное старение. Данное свойство привлекло внимание медиков.

Опухолевые стволовые клетки выявлены при различных видах рака (мозга, яичников, молочной железы, меланоме и пр.), в результате чего возникла идея, что стволовые клетки и рак взаимосвязаны.

Результаты исследований подтвердили, что стволовые клетки и рак взаимосвязаны. Связь была установлена специалистами ведущих исследовательских центров. Однако утверждать, что стволовые клетки – причина рака у здоровых людей, ученые пока не могут.

Почему стволовые клетки становятся раковыми

С точки зрения ученых ответ на вопрос относительно того, почему они взывают рак, кроется в свойствах опухолевых стволовых клеток. Злокачественные новообразования развиваются из одной клетки, которая является результатом трансформации нормальной клетки в результате каких-то событий в раковую. Делением этой клетки создается злокачественная опухоль. Поскольку раковые клетки являются истинно ствольными клетками, делиться и постоянно самовоспроизводиться они могут неограниченно. Стволовые клетки и рак связаны, поскольку злокачественные новообразования являются результатом деления трансформировавшихся стволовых клеток.

Лечение рака стволовыми клетками изначально казалось перспективным направлением, в частности в области лечения рака мозга. Данные многочисленных исследований, проведенных в разных странах, подтвердили, что стволовые клетки и рак взаимосвязаны, поэтому использование стволовых клеток может стать причиной появления новых злокачественных опухолей или увеличения уже существующих. Стволовые клетки, мигрируя с кровотоком, могут стать причиной возникновения новообразований или стимулировать рост имеющихся опухолей.

Взаимосвязь регенерации и развития заболевания

Связь изучали, в том числе в целях использования стволовых клеток для восстановления здоровья больных раком, в плане регенерации поврежденных тканей. Регенерация предусматривает их активное использование в режиме турбо, но при этом стволовые клетки работают с перегрузками. Если функции генов нарушаются и иммунная защита организма на какое-то время понижается, то стволовая клетка начинает активно самовоспроизводиться, будучи поврежденной. В результате раковые клетки размножаются, формируя злокачественную опухоль.

Если вы заметили симптомы этого страшного заболевания, важно как можно быстрее обратиться к опытным и хорошо себя зарекомендовавшим специалистам. Относитесь к их выбору предельно серьезно, ведь этим врачам вы доверите свое здоровье. Выбирайте клиники, которые продолжительное время работают в этой сфере и имеют положительные результаты лечения.

Исследования стволовых клеток не случайно относят к высоким технологиям. Наша цивилизация стремится к раскрытию тайн мироздания, пониманию природы роста и развития, старения и смерти человека. На наших глазах рождаются новые стратегии, инструменты и методы спасения здоровья и жизни человека. Клеточные технологии поднимают медицину на качественно новый уровень — регенеративный. Возможным становится исправить то, что еще вчера считалось необратимым восстановить утраченные, поврежденные или стареющие органы и ткани. Очевидна огромная социальная значимость подобных исследований.

Прогресс мировой науки в текущем столетии связывается с развитием биологии, существенная роль в котором будет принадлежать именно клеточным технологиям. The Wall Street Journal опубликовал прогноз, согласно которому одними из самых востребованных станут специалисты в инновационной сфере — биомедицинской инженерии. Здравоохранение США делает ставку на выращивание искусственных органов и развитие систем визуализации. В этих сферах количество рабочих мест увеличится на 72%. В ближайшем будущем биомедицинские технологии, возможно, будут локомотивом мировой экономики.

К сожалению, в России специалистов не много, да и их мнение не очень интересно — оно не сенсационно. Для нашей страны характерна крайность суждений. От чуда до беды. Зато модно порассуждать о стволовых клетках. Последнее время в прессе активно обсуждается связь стволовых клеток и рака.

Строго говоря в биологии развития еще в 70-80-х годах прошлого столетия установлено, что стволовые клетки не подвергаются опухолевой трансформации, то есть, нормальные стволовые клетки не могут превратиться в опухолевые клетки. На научном языке это звучит, как ограничение компетенции к опухолевой трансформации, определяемое стадией дифференцировки.

Во-первых, если в лабораторных условиях воспроизвести искусственное оплодотворение, выделить в течение первых дней делящиеся эмбриональные стволовые клетки, нарастить их биомассу в биореакторе и затем ввести во взрослый организм, то в некоторых случаях (чаще при отсутствии или ослаблении иммунитета) введенные клетки образуют первично доброкачественную опухоль — тератому. Это особенная опухоль, состоящая из тканей нескольких типов, производных одного, двух или трех зародышевых листков. Никогда введенные эмбриональные стволовые клетки не сформируют ни рак легких, ни рак молочной железы, желудка, крови и т. д. То есть после введение эмбриональных стволовых клеток не возникнут те формы опухолей, от которых обычно умирают люди. Если же эмбриональные стволовые клетки ввести в зародыш человека, никакой опухоли не будет вообще.

Если ввести эмбриональные стволовые клетки, то совершенно необязательно, что разовьется опухоль. Так, в Индии в Institute of Transplantation Sciences (Гуджарат) для спасения донорской почки от отторжения пациенту внутривенно была введена большая доза эмбриональных стволовых клеток. Пациент восстановил функцию пересаженной почки, и это произошло без приема иммуносупрессантов. Осложнений не было, и такой способ лечения был признан индийскими трансплантологами безопасным.

Более того, как показали исследования профессора Джона Итона в Университете Луизианы (США), эмбриональные стволовые клетки могут быть использованы в качестве противораковой вакцины. Такая вакцина в 80% случаев предотвращала развитие опухолей у животных в эксперименте. Добавление к стволовым клеткам особых фибробластов (STO/GM-CSF) повышало ее эффективность до 100%.

Во-вторых, онкологи открыли в злокачественных новообразованиях собственные стволовые опухолевые клетки. Это немногочисленная субпопуляция наименее специализированных раковых клеток, которые обладают способностью к самообновлению и дают начало всем клеточным популяциям, присутствующим в исходной опухоли, в том числе инициируют неоангиогенез и рост стромы опухоли. Во всех нормальных органах и тканях присутствуют стволовые клетки, которые ответственны за самообновление — физиологическую или репаративную регенерацию, а также более специализированные и зрелые клетки, выполняющие основные функции органа или ткани. То же характерно и для опухоли. То есть опухоль по строению напоминает орган (органоидные опухоли) или ткань (гистиоидные опухоли) и, понятно, отличаться от общего принципа построения биологических структур не должна.

Надо отметить, что долгое время стоял вопрос, насколько раковые стволовые клетки похожи на нормальные стволовые клетки. И какой именно тип стволовых клеток первым начинает изменяться при злокачественном новообразовании. Предполагалось, что опухоль начинается с изменений в полностью недифференцированных стволовых клетках, дающих начало всем остальным клеткам, способным к почти неограниченному самообновлению.Однако американские онкологи, исследующие раковые стволовые клетки при лейкемии, обнаружили, что эти важные клетки — самовоспроизводящиеся зачатки опухолей происходят не из недифференцированных стволовых клеток, а от их потомства — частично коммитированных несамообновляющихся клеток-предшественников (короткоживущих клеток, которые могут дать начало нескольким, но не всем типам клеток крови). Более того, под руководством профессоров Голуба и Армстронга было показано, что генетическая программа полностью развитых лейкемических стволовых клеток не такая, как у нормальных СК. Это очень важное открытие, которое с большой долей вероятности будет характерно и для большинства других видов опухолей, потому что важнейшими свойствами стволовых клеток являются устойчивость к действию повреждающих факторов и редкое деление. Эти свойства не позволяют стволовым клеткам накопить ту массу генетических изменений, которая необходима для трансформации нормальной клетки в раковую. А вот прогенеторные клетки, наоборот, активно размножаются, но менее пластичны, чем стволовые клетки. Они коммитированы, и пути их дальнейшего развития предопределены экспрессией генов и ограничены. Что это значит?

Это объясняет, почему раковая стволовая клетка лейкоза ни при каких обстоятельствах не станет стволовой клеткой рака желудка. Стволовая клетка рака груди не станет стволовой клеткой рака легкого. Стволовая клетка рака кожи не станет стволовой клеткой саркомы и т.д. И наоборот. Это перечисление можно продолжать. Итак, источником злокачественных опухолей, как правило, а для наиболее часто встречаемых форм рака, вероятно, всегда являются коммитированные клетки. Это клетки-предшественницы, которые уже необратимо определились как предки клеток определенной опухоли, как правило, одного типа. Для опухоли характерна прогрессия с потерей степени специализации, но не переход одного вида злокачественного новообразования в другой. Даже при канцерогенезе все события происходят на разных уровнях структурной организации онкологического больного и представляют собой не хаос, а подчиняющиеся определенным законам взаимосвязанные процессы.

То же характерно и для нормальных стволовых клеток. Те популяции стволовых клеток, которые сегодня применяются для разных терапевтических целей, не могут превратиться как минимум в рак — опухоль эпителиального происхождения. Мультипотентные мезенхимальные стволовые клетки, имеющие мезодермальное происхождение, не превратятся в клетки рака желудка — атипичный эпителий, который имеет эндодермальное происхождение. Гемопоэтическая стволовая клетка никогда не превратится в атипичную клетку почечно-клеточной карциномы и т.д.

Еще раз подчеркнем, что нормальные стволовые и раковые стволовые клетки резко отличаются на главном, генетическом уровне. Это положение находит многочисленные подтверждения. Так, учеными Стэнфордского университета (Калифорния) и Института Вайцмана (Израиль) убедительно показаны различия транскрипционных программ в разных типах стволовых клеток.

Гениальные ученые Говард Чан и Эран Сигал создали карту генных модулей, помогающую сравнивать и систематизировать транскрипционные программы эмбриональных стволовых клеток, нормальных клеток взрослого организма и раковых клеток. С помощью карты генных модулей исследователи идентифицировали два преобладающих генных модуля, обеспечивающих различия эмбриональных и взрослых стволовых клеток.

Для эмбриональных стволовых клеток и клеток различных типов рака характерна экспрессия генов, находящихся в нормальных дифференцированных клетках в подавленном состоянии. Интересен тот факт, что транскрипционная программа, напоминающая программу эмбриональных стволовых клеток, активирована в клетках различных типов человеческих злокачественных опухолей эпителиального происхождения и является четким прогностическим фактором быстрого распространения опухоли по организму и гибели пациентов. Для генного модуля взрослых стволовых клеток характерна противоположная модель: он активирован в нормальных тканях и подавлен в злокачественных опухолях. Был сделан важный вывод, о том, что такая существенная перестройка активности генов не может произойти быстро и беспричинно. Это длительный процесс, часто протекающий под влиянием канцерогенных воздействий или при иммунологических нарушениях.

Бум исследований стволовых клеток породил большую путаницу в головах многих исследователей, впервые обратившихся к этой теме. Пластичность многих популяций нормальных стволовых клеток значительно переоценена. Появились утверждения, что стволовые клетки нервной ткани могут превратиться в миоциты или гепатоциты; мезенхимальные стволовые клетки — в остеобласты, кардиомиоциты; стволовые клетки печеночной ткани способны превратиться в нейроны и миоциты и т.д. Для приобретения такой возможности трансдифференцировки коммитированные стволовые клетки должны дедифференцироваться до эмбрионального состояния, чтобы вновь обрести тотипотентность, то есть способность дифференцироваться в любой тип клеток. На самых разных примерах морфогенеза показано, что полной дедифференцировки в природе нет и, вероятно, такой сценарий событий вообще невозможен.

Я полностью согласен с высказыванием наших замечательных ученых, профессоров Е. А. Зотикова и А. Г. Бабаевой, что роль стволовых клеток (авт. — стволовой кроветворной клетки) в организме исключительно велика, но механизмы реализации этой роли, прежде всего, в их индукционных и информационных свойствах.

Аналогичные данные получили онкологи Cedars-Sinai Medical Center (Лос-Анжелес, Калифорния). Они показали, что нейральные стволовые клетки, полученные из стволовых клеток костного мозга, выделяют цитокины, уничтожающие клетки злокачественных опухолей головного мозга, и дают надежную долговременную защиту от рецидивов опухоли.

Сотрудники южнокорейской биофармацевтической компании RNL BIO исследуют возможность коммерческого применения стволовых клеток для лечения злокачественных опухолей. В экспериментах стволовые клетки вводились в организм как внутривенно, так и подкожно. В качестве подопытных животных использовали собак, которые были поражены большими злокачественными опухолями. В сравнении с контрольной группой у собак после трансплантации стволовых клеток опухоли заметно сократились в размерах. Несмотря на факт, что введение стволовых клеток в этом эксперименте не излечило собак от рака, убедительно показано, что трансплантация клеток существенно продлила продолжительность жизни собак в опытной группе.

Подобный результат учеными этой компании был достигнут и в эксперименте на лабораторных мышах. Для биотерапии рака у грызунов применили ксенотрансплантацию человеческих стволовых клеток. Стволовые клетки вводились внутривенно группе мышей, которые были поражены очень злокачественной опухолью — меланомой. У подопытных грызунов, так же как и в эксперименте на собаках, злокачественные опухоли уменьшились в размерах, а срок жизни мышей благодаря пересадке стволовых клеток, значительно увеличился.

В Институте стволовых клеток при Университете Коннектикута (США) обнаружено, что ксенотрансплантация человеческих эмбриональных стволовых клеток мышам, у которых развивались раковые опухоли, приводила к замедлению роста злокачественных опухолей.

Исследователи Института стволовых клеток из Университета Коннектикута под руководством профессора Ли обнаружили, что после вакцинации человеческими эмбриональными стволовыми клетками, лабораторные мыши, больные раком, приобретали способность к борьбе против опухоли, в их организмах начинала развиваться защитная реакция иммунной системы, направленная против клеток рака их толстой кишки. Мыши,вакцинированные стволовыми клетками,показали резкое снижение темпов роста опухоли, по сравнению с животными, которым стволовые клетки человека не вводили.

Свойство стволовых клеток и клеток-предшественников находить опухоль и тормозить её рост, американские ученые-онкологи решили использовать и усилить за счет генетических модификаций. В эксперименте с мышами исследователи из Университета Джона Хопкинса под руководством профессора Альфредо Хиноне-Инохоса применили генетически модифицированные мезенхимальные стволовые клетки (МСК) против опухоли мозга — глиобластомы. В результате модификации МСК начали усиленно синтезировать костный морфогенетический белок 4 (BMP4; bone morphogenetic protein 4), который нужен для нормального развития эмбриона и, в дальнейшем, скелета, а также обладает свойством подавлять рост опухолей. Нейрохирурги в эксперименте на мышах вводили такие модифицированные МСК непосредственно в пораженный опухолью мозг.

Впервые эффект слияния (cellfusion) воедино здоровых и опухолевых клеток был изучен еще в прошлом веке. В 1969 вдающиеся интеллектуалы профессор сэр Генри Харрис в Лондоне, в сотрудничестве с профессором Джорджем Клейном в Стокгольме, провели уникальные эксперименты. Нормальные клетки соединительной ткани — фибробласты сливали с клетками, полученными от разных злокачественных опухолей. Гибриды имели все морфологические (структурные) и функциональные признаки нормальных фибробластов. Ученые сделали вывод, что нормальные гены имели способность подавлять злокачественные образования. Эти гены, теперь известны, как гены-супрессоры.Оказалось, что гибриды (речь идет о соматической гибридизации) любых здоровых и опухолевых клеток — всегда (с рядом оговорок) проявляют себя, как нормальные, а при слиянии двух опухолевых — возникает гибридная клетка, всегда со всеми свойствами раковой. Ученые сделали два важнейших вывода. Во-первых, изменение генома в раковых клетках носит рецессивный характер; а во-вторых, при канцерогенезе происходит утрата наследственной информации, а не её приобретение.

Да, некоторые популяции стволовых клеток при миграции в опухоль, возможно, могут усилить рост стромы и даже паренхимы опухоли, простимулировать рост новых сосудов, облегчить метастазирование. Но принципиально повлиять на приобретение злокачественных свойств, скорее всего, нет. Так как известно, что развитие опухоли включает последовательные циклы мутаций и естественного отбора. В роли естественного отбора выступают защитные силы организма, активно уничтожающие измененные клетки. По имеющимся данным, скорость превращения измененной клетки в раковую клетку зависит от четырех основных показателей.

А именно: 1) скорости мутирования, или частоты возникновения мутаций; 2) численности популяции мутировавших клеток; 3) скорости размножения; 4) селективного преимущества генетически измененной клетки, которое оценивается как отношение числа выживших в организме способных к делению потомков клетки, произведенных ею за единицу времени, к такому же показателю числа потомков немутантной клетки (Alberts B., et al., 1989). Роль в этих процессах трансплантированных стволовых клеток, вероятно, не может быть значительна.

Свойство стволовых клеток находить опухоль может иметь практическое значение. Благодаря радиоактивным меткам удается с помощью введения стволовых клеток обнаружить очаги злокачественного роста, которые нельзя было обнаружить другими методами визуализации. От того, насколько своевременно диагностирован злокачественный рост, зависят жизнь пациента и эффективность лечения в онкологии. Стволовые клетки можно модифицировать и использовать как самонаводящиеся снаряды для спасения людей, пораженных злокачественным новообразованием.

Тест EarlyCDT®-Lung позволяет исследовать кровь человека для ранней диагностики рака легких. По-сравнению с существующими методами диагностики рака легких тест позволяет обнаружить развитие злокачественной опухоли даже за 5 лет до того момента, когда ее можно будет увидеть с помощью самых современных приборов медицинской визуализации. С помощью лучших образцов компьютерных томографов засечь вероятный очаг развития рака можно только при достижении опухолью размера 2 мм. Но это, конечно, только теоретически. Очевидно визуализируется очаг размером не менее 8 мм в диаметре. Это уже активно прогрессирующая опухоль. Симптомы поражения легких, которые может почувствовать раковый больной, возникают при размере опухоли около 4 см. Опухоль диаметром 10 см уже, как правило, несовместима с жизнью.

Для специалиста понятно, что разные клеточные популяции стволовых клеток могут быть применены и эффективно, и безопасно. Это серьезные наукоемкие технологии, которые требуют государственной поддержки, материального обеспечения, грамотного подхода, адекватного целям и поставленным задачам. Клеточные технологии — это то новое направление биомедицины, которое надо развивать и поддерживать. Я убежден, что именно в области клеточных технологий родится стратегия, которая избавит человечество от дамоклова меча рака.

Ковалёв Алексей Вячеславович,
старший научный сотрудник, к.м.н.,
профессор Российской академии естествознания