Молекулярные клеточные маркеры рака

Биология XX века расшифровала молекулярные основы жизни.

Со всей очевидностью продемонстрировано, что любой живой организм состоит из многообразных раздельных форм.

Тем самым удалось существенно приблизиться к практическому решению ряда принципиальных вопросов, которые связаны с диагностикой и лечением онкологических заболеваний.

Показательно, что ранее присуждения Нобелевской премии Кери Мюллису за открытие в 1983 году полимеразной цепной реакции (ПЦР), ученый был награжден премией Международной федерации клинической химии и лабораторной медицины. Действительно, как убеждают теоретические расчеты, использование метода ПЦР позволяет обнаружить наличие у пациента опухолевого очага размером от 0,01 мм3.

Применение молекулярно-биологических технологий диагностики в практической онкологии подчинено решению следующих вопросов:

• диагностика наследственных форм рака;
• определение молекулярных маркеров ранних (доклинических) стадий развития опухоли;
• диагностика молекулярных маркеров неблагоприятной динамики заболевания;
• поиск опухолевых маркеров рецидива опухоли, а также выявление микрометастазов;
• определение полиморфных молекулярных маркеров, ассоциирующихся с повышенным риском развития того или иного типа опухоли. Фундаментальные исследования молекулярных основ канцерогенеза выявили ключевую роль в нем повреждения дезоксирибонуклеиновой кислоты (ДНК).

Определены и наиболее значимые в данном случае эффекты:

• хромосомные перестройки и мутации генов;
• онкогенное влияние ряда вирусов, способных взаимодействовать с геном клеток и встраиваться в молекулу ДНК.

Можно считать доказанным, что делеции определенных участков хромосом обуславливают заболевания различными типами рака (Табл.1).

Таблица 1. Хромосомные мутации при основных злокачественных новообразованиях.

Не менее ясно, что мутации таких генов, как BRCA1, BRCA2, TP53, CHEK2, ATM, PIK3CA, ING4 вовлечены в процесс канцерогенеза при раке молочной железы; HRAS1, CDKN2A, p14ARF/p15 — при раке мочевого пузыря; RNASEL, ELAC2, MSR1, RTEN, KLF6, FEZ1 — при раке предстательной железы; VHL, TP53, CDKN2A — при раке почки.

К настоящему времени изучено большое количество онкогенов или доминантных раковых генов, активация которых вызывает злокачественную трансформацию клетки. Таким образом, в организме инициируется процесс формирования ее опухолевого клона.

Пристальное внимание уделяют классу антионкогенов или генам-супрессорам, продукты, которых угнетают митотическую активность клеток.

Наиболее мощным и универсальным в данном случае является ген p53, который в геноме человека размещен на коротком плече хромосомы 17 (локус 17p13.1). Соответствующий ген кодирует биосинтез ядерного фосфопротеида, включающего 393 аминокислотных остатков. Указанное соединение выполняет регуляторную роль в цикле клеточного деления. Продукт гена p53 также отвечает за процесс апоптического самоустранения клеток, которые получили критические повреждения ДНК.

Дезорганизация нормального функционирования гена p53 сопряжена с утратой контроля над клеточным циклом. В результате этого клетки, несмотря на имеющиеся повреждения молекулы ДНК, продолжают активно пролиферировать, что приводит к развитию опухоли.

Установлено наличие тесной взаимосвязи между инактивацией гена p53 и возникновением свыше 50 видов различных злокачественных новообразований (рак легкого, молочной железы, шейки матки, яичников и др.).

Ген RB1, который также входит в класс генов-супрессоров опухолевого роста, оказался первым геном, на примере которого Кнудсон еще в 1971 году сформулировал двухударную теорию канцерогенеза.

Первое из них — мутация, приводящая к образованию клетки, для которой повышен риск злокачественной трансформации. Подробные мутации могут возникать как в соматических, так и в половых (герминальных) клетках. При обнаружении носительства герминальной мутации в гене RB1 у плода, риск развития ретинобластомы составляет 90%.

Структурные изменения, затрагивающие ген RB1, и/или потеря гетерозиготности в области 13q14 были обнаружены в таких опухолях, как мелкоклеточный рак легкого (15%), опухоли яичников, молочной железы (25%), что подчеркивает роль RB1 в регуляции нормального функционирования различных тканей.

Наличие тесной взаимосвязи отдельных генов в регуляции процессов пролиферации, дифференцировки и апоптоза клетки, позволяет считать вероятным их комплексное повреждение при канцерогенезе.

В связи с этим неизменно актуальные поиски причинно-следственной связи инактивации соответствующих генов с процессом опухолевой трансформации.

Изучение механизмов возникновения и прогрессирования опухоли позволило охарактеризовать значение не только структурных изменений генов, но и эпигенетических (функциональных) факторов их регуляции (изменения, не влияющие на нуклеотидную последовательность ДНК, но сопряженные с нарушением экспрессии гена).

В результате дисбаланса метилирования наступает блокировка синтеза белковых продуктов, которые необходимы для физиологической регуляции клеточного цикла, процессов дифференцировки и апоптоза. Все это приводит к опухолевой трансформации клетки.

Аномальное метилирование как механизм, приводящий к инактивации генов-супрессоров опухолевого роста, впервые был описан для гена RB1 (Sakai et al., 1991).

Для ДНК-диагностики сейчас используют разнообразные методы скрининга мутаций. Наиболее доступна идентификация мутаций, изменяющих длину амплифицированных фрагментов, которые затем выявляют при электрофоретическом анализе.

Протяженные делеции могут быть выявлены с помощью анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ) или с использованием дозового блотгибридизационного анализа.

С целью поиска точковых мутаций, небольших делеций и инсерций в исследуемых генах используют множество различных подходов, основанных на методе полимеразной цепной реакции. Продукты амплификации являются объектами дальнейшего поиска мутаций с помощью ряда методов, позволяющих выявлять различные структурные изменения.

Метод метилчувствительной полимеразной цепной реакции

Для определения метилирования уже известных последовательностей ДНК применяют метод метилчувствительной ПЦР (МЧ-ПЦР).

Метилспецифическая полимеразная цепная реакция (МС-ПЦР) — метод, позволяющий оценивать состояние метилирования индивидуальных CpG-островков независимо от расположения сайтов узнавания метилчувствительных рестриктаз и особенностей метилирования аллей различного родительского происхождения.

Необходимым условием проведения исследований в области функциональной геномики и протеомики является наличие технологий и специализированного оборудования для высокопроизводительного анализа многокомпонентных биологических микрочипов (биочипов). Разработка биочиповой технологии стала возможной благодаря достижениям в области промышленного производства миниатюрных устройств, несущих многие десятки тысяч функциональных элементов на поверхностях ограниченной площади.

Идея использовать для гибридизационного анализа ДНК плоские стеклянные слайды-пластины (ДНК-биочипы) с иммобилизованными на них синтетическими олигонуклеотидами возникла в конце 1980-х — начале 1990-х годов в связи с необходимостью проведения структурного анализа протяженных фрагментов геномной ДНК.

Биочип, как правило, представляет собой слайд-пластинку площадью от 0,1 до 10 см3 с фиксированными на поверхности в виде индивидуальных микроточек (диаметр от 10 до 500 мкм) образцами биологически активных веществ.

Современные технологии микропечати позволяют наносить на биочип десятки тысяч индивидуальных образцов нуклеиновых кислот, белков, пептидов, полисахаридов, культур клеток, микроорганизмов и т.д. При этом необходимые количества индивидуальных препаратов составляют подчас лишь триллионные и миллиардные доли грамма (пико- и нанограммы).

Практически любые органические субстанции после несложной предварительной обработки могут быть подвергнуты анализу с помощью биочипа. Для этого экстрагированные из препаратов и химически модифицированные нуклеиновые кислоты (ДНК и рибонуклеиновая кислота (РНК)) или белки должны быть перенесены на поверхность микрочипа, с тем, чтобы осуществить регистрацию процессов межмолекулярных взаимодействий на поверхности биочипа за счет использования флуоресцентных, хемилюминесцентных или масс-спектрометрических методов.

С известной условностью можно выделить три основных типа ДНК-биочипов используемых в качестве диагностического инструмента:

• биочипы для сравнительного гибридизационного генетического анализа;
• биочипы для исследования уровней экспрессии генов;
• биочип для выявления мутаций и участков (сайтов) полиморфизма.

В настоящее время накоплен огромный объем информации, характеризующие профили экспрессии генов в клетках нормальных тканей, опухолевых клеточных линиях и трансформированных клетках из опухолевых тканей. Полученные данные включают в специализированные базы данных, которые содержат программные средства, помогающие правильно интерпретировать результаты сравнительных анализов профилей экспрессии в контексте известных биохимических схем.

Если принимать во внимание только максимально перспективные исследования, уже сейчас не трудно выделить шесть научно-прикладных направлений молекулярной диагностики в онкологии:

• идентификация маркеров, которые характерны для пусковых стадий опухолевого роста;
• обнаружение генетических нарушений, сигнализирующих о реальности неблагоприятного прогноза развития заболевания и высокой инвазивности опухоли (выраженность ее метастатического потенциала, невосприимчивость к рационально назначаемой терапии, короткая продолжительность достигаемых периодов ремиссии, значительное ухудшение качества жизни пациента);
• диагностика наличия микрометастазов;
• тестирование наследственных форм опухоли;
• поиск маркеров (полиморфных форм ДНК), определяющих эффективность химиотерапии и назначения таргетных препаратов (таргетная терапия основана на коррекции молекулярных дефектов, которые возникают в геноме клетки при опухолевой трансформации);
• анализ ДНК-полиморфизмов, повышающих риск развития конкретного типа опухоли в группах риска.

Необходимым итогом молекулярно-генетических исследований онкологии должно стать создание комплексной диагностической системы, которая будет эффективно интегрировать новейшие достижения молекулярной генетики, фундаментальной и прикладной биохимии, а также клинической онкологии.

Презентация на тему: " Молекулярные маркеры опухолей в клинике – история, настоящее и будущее Елена Сергеевна Герштейн Лаборатория клинической биохимии НИИ КО РОНЦ им.Н.Н.Блохина." — Транскрипт:

1 Молекулярные маркеры опухолей в клинике – история, настоящее и будущее Елена Сергеевна Герштейн Лаборатория клинической биохимии НИИ КО РОНЦ им.Н.Н.Блохина РАМН, Москва. Национальные дни лабораторной медицины России – октября 2011 г. Москва

2 Молекулярные (клеточные, тканевые, биологические) маркеры опухолей: Определяются непосредственно в опухолевой ткани или в субклеточных фракциях (цитозоль, мембраны и т.п.). Определяются непосредственно в опухолевой ткани или в субклеточных фракциях (цитозоль, мембраны и т.п.). Характеризуют биологические особенности опухоли: способность к пролиферации или метастазированию, гормональную и/или лекарственную чувствительность и др. Характеризуют биологические особенности опухоли: способность к пролиферации или метастазированию, гормональную и/или лекарственную чувствительность и др.

3 2. Предсказание эффективности и выбор адъювантного лечения, в.т.ч. оценка чувствительности к препаратам направленного действия Два этапа использования тканевых маркеров 1. Прогноз течения заболевания и формирование групп повышенного риска рецидивирования и/или метастазирования Благоприятный прогноз – наблюдение Неблагоприятный прогноз Больные распространенными стадиями

4 Основные условия включения маркера в схему обследования больного и использования результатов для выбора лечения (Hayes et al., 1996) : Использование маркера должно приводить к более благоприятным результатам лечения - увеличению безрецидивной или общей выживаемости и/или улучшению качества жизни и/или снижению стоимости лечения. Использование маркера должно приводить к более благоприятным результатам лечения - увеличению безрецидивной или общей выживаемости и/или улучшению качества жизни и/или снижению стоимости лечения. Эти преимущества должны иметь I уровень доказательности (ASCO) – доказательства получены либо в специальном большом рандомизированном проспективном исследовании, либо в результате мета-анализа большого числа относительно небольших проспективных исследований. Эти преимущества должны иметь I уровень доказательности (ASCO) – доказательства получены либо в специальном большом рандомизированном проспективном исследовании, либо в результате мета-анализа большого числа относительно небольших проспективных исследований. Необходимы стандартизованные воспроизводимые методы с четко обозначенными критериями, а также наличие внутренних и внешних программ контроля качества. Необходимы стандартизованные воспроизводимые методы с четко обозначенными критериями, а также наличие внутренних и внешних программ контроля качества.

5 Где и как определяют биологические маркеры? 1 = увеличение количества копий гена 2 = более высокий уровень транскрипции мРНК 3 = увеличение количества белка в/на клетке 4 = секреция белка или его фрагмента Изменение функциональной активности белка A = ДНК B = мРНК C = белок Нормальный уровень маркера Ядро Цитоплазма Клеточная мембрана C B A C Амплификация/гиперэкспрессия

6 Рецепторы стероидных гормонов – критерий чувствительности к эндокринной терапии

7 C Р + мРНК Белки C ДНК Схема действия стероидных гормонов на клетку

8 Основные методы определения рецепторов стероидных гормонов Метод ПреимуществаНедостатки Радио- лигандный Объективный количественный метод, легко поддающийся контролю и позволяющий оценить функциональную активность рецепторов Нельзя четко определить принадлежность рецепторов опухолевым клеткам. Необходимость использовать только свежезамороженные ткани. Иммуногистохи- мический (ИГХ) Можно четко определить принадлежность рецепторов именно опухолевым клеткам. Возможность работы с архивным материалом (блоки и стекла). Полуколичественный метод, не охваченный программами контроля качества. Не оценивает функциональную активность рецепторов.

9 Присутствие в первичной опухоли молочной железы рецепторов эстрогенов (РЭ) свидетельствует о ее потенциальной чувствительности к лечебным мероприятиям, направленным на удаление источника эстрогенов из организма или на противодействие их эффектам. Присутствие в первичной опухоли молочной железы рецепторов эстрогенов (РЭ) свидетельствует о ее потенциальной чувствительности к лечебным мероприятиям, направленным на удаление источника эстрогенов из организма или на противодействие их эффектам. Наличие рецепторов прогестерона (РП) не только является первым необходимым звеном реакции клетки на прогестины и определяет ее чувствительность к соответствующим препаратам, но может также свидетельствовать о функциональной активности РЭ. Наличие рецепторов прогестерона (РП) не только является первым необходимым звеном реакции клетки на прогестины и определяет ее чувствительность к соответствующим препаратам, но может также свидетельствовать о функциональной активности РЭ.

10 Клиническое значение определения рецепторов стероидных гормонов Эффективность эндокринной терапии распространенного рака молочной железы составляет около 10% при рецепторотрицательных опухолях, примерно 50% - при РЭ-положительных опухолях и 75% - при опухолях, содержащих РЭ и РП. Эффективность эндокринной терапии распространенного рака молочной железы составляет около 10% при рецепторотрицательных опухолях, примерно 50% - при РЭ-положительных опухолях и 75% - при опухолях, содержащих РЭ и РП. Наличие в первичной опухоли молочной железы РЭ и/или РП свидетельствует об относительно благоприятном прогнозе, хотя разница в выживаемости между группами больных с рецепторположительными и рецептор- отрицательными опухолями составляет, как правило, не более 10%. Наличие в первичной опухоли молочной железы РЭ и/или РП свидетельствует об относительно благоприятном прогнозе, хотя разница в выживаемости между группами больных с рецепторположительными и рецептор- отрицательными опухолями составляет, как правило, не более 10%. Подтверждено мета-анализом, включавшим больных операбельным раком молочной железы, участвовавших в 55 рандомизированных исследованиях Подтверждено мета-анализом, включавшим больных операбельным раком молочной железы, участвовавших в 55 рандомизированных исследованиях Early Breast Cancer Trialists Collaborative Group. Lancet 1998

11 Факторы роста и их рецепторы – показатель способности опухоли к саморегулируемой пролиферации.

12 Общая схема продукции и действия факторов роста Клетка-продуцент Клетка-акцептор Фактор роста Аутокринное действие Паракринное действие

14 Взаимосвязь между статусом РЭФР и выживаемостью больных раком молочной железы Количество исследовательских групп, занимавшихся этой проблемой с 1984 г Количество исследовательских групп, занимавшихся этой проблемой с 1984 г Число прослеженных больных ; всего – около 6000 Число прослеженных больных ; всего – около 6000 Процент РЭФР-полжительных опухолей - 14% - 67% Процент РЭФР-полжительных опухолей - 14% - 67% Радиолигандный метод использован в 15 исследованиях; иммуногистохимический - в 8; иммуноферментный - в 2; гибридизационный - в 2. Радиолигандный метод использован в 15 исследованиях; иммуногистохимический - в 8; иммуноферментный - в 2; гибридизационный - в 2. Длительность наблюдения месяцев Длительность наблюдения месяцев Отрицательную корреляцию с безрецидивной выживаемостью обнаружили 15 групп. Отрицательную корреляцию с безрецидивной выживаемостью обнаружили 15 групп. Отрицательную корреляцию с общей выживаемостью - 6 из 11 групп. Отрицательную корреляцию с общей выживаемостью - 6 из 11 групп. Прогностическая значимость РЭФР подтверждена в 6 из 10 многофакторных исследований. Прогностическая значимость РЭФР подтверждена в 6 из 10 многофакторных исследований. В 3 исследованиях показано, что высокая экспрессия РЭФР свидетельствует о гормонорезистентности опухоли, независимо от статуса рецепторов стероидных гормонов В 3 исследованиях показано, что высокая экспрессия РЭФР свидетельствует о гормонорезистентности опухоли, независимо от статуса рецепторов стероидных гормонов

15 Использование результатов определения РЭФР и рецепторов стероидных гормонов при выборе метода послеоперационного лечения больных РМЖ N-N- РЭФР +, в особенности, РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП РЭФР +, в особенности, РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП Группа с неблагоприятным прогнозом, требующая тщательного наблюдения и, возможно, адъювантной терапии без гормонов РЭФР РП + РЭ + Прогностически благоприятная группа – без лечения при отсутствии клинических показаний N+N+ РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП РЭФР + РП РЭ или РЭФР + РП Комплексное лечение без гормонального компонента РЭФР РП + РЭ +, а также все РП+ опухоли Лечение, включающее гормональный компонент

16 Р Р Y Y Cys P Трансмембранная спираль Киназный участок Аутофосфори- лируемый фрагмент РЕЦЕПТОР ЭФР Лиганд-связывающий домен Блокаторы связывания лиганда с рецептором; Конъюгаты факторов роста и токсинов Ингибиторы тирозинкиназы

17 Препараты, направленно действующие на рецепторы семейства с-erbB Препарат Рецептор- мишень Механизм действия Год Герцептин(трастузумаб) HER2 мАТ к проксимальному внеклеточному домену 1998 Иресса(гефитиниб) HER1 – РЭФР Специфический низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы 2003 Эрбитукс(цетуксимаб) HER1 – РЭФР мАТ к внеклеточному домену 2004 Тарцева(эрлотиниб) HER1 – РЭФР Специфический низкомолекулярный ингибитор тирозинкиназы 2005 Омнитарг(пертузумаб) HER2 мАТ - ингибитор димеризации (HDI ) 2005 Тайверб (lлапатиниб) HER1 – HER2 Двойной ТК инкибитор 2006 Вектибикс (панитумумаб) HER1 – РЭФР мАТ к лиганд-связывающему домену

18 HER2/neu (c-erbB-2) – мишень для специфической терапии

19 Что такое HER2/neu ? ( H uman E pidermal growth factor R eceptor 2 ) Представитель семейства трансмембранных тирозинкиназных рецепторов, продуктов онкогенов группы c-erbB, в которое входит РЭФР, - одной из важнейших систем передачи митогенного сигнала. Представитель семейства трансмембранных тирозинкиназных рецепторов, продуктов онкогенов группы c-erbB, в которое входит РЭФР, - одной из важнейших систем передачи митогенного сигнала. Уникальный рецептор-диспетчер, который, не имея собственного лиганда, образует наиболее функционально активные димеры с другими рецепторами своего семейства и усиливает их эффекты. Уникальный рецептор-диспетчер, который, не имея собственного лиганда, образует наиболее функционально активные димеры с другими рецепторами своего семейства и усиливает их эффекты.

20 Трансактивация рецепторов семейства с-erbB с участием безлигандного рецептора HER2/neu. Клеточная мембрана Связывание лиганда Активированный гетеродимер Y Y Y Y P P P P Пролиферация Миграция Опухолевый рост и метастазирование Выживание Передача сигнала Тирозинкиназный рецептор Киназный домен HER2

21 Методы определения HER2 Иммуногистохимический метод визуализации белка на опухолевых клетках – первичный скрининг: Флуоресцентная гибридизация in situ (FISH) для оценки амплификации гена при ИГХ 2+:

22 Прогностическое значение HER2/neu Прогностическая ценность исследования HER2/neu при раннем РМЖ неоднозначна, однако с 2005 г. этот маркер включен в число факторов, учитываемых в т.н. Сент-Галленском прогностическом индексе. Прогностическая ценность исследования HER2/neu при раннем РМЖ неоднозначна, однако с 2005 г. этот маркер включен в число факторов, учитываемых в т.н. Сент-Галленском прогностическом индексе. Есть данные о том, что опухоли с амплифицированным геном HER2/neu слабо реагируют на эндокринную терапию, но чувствительны к последующей химиотерапии. Есть данные о том, что опухоли с амплифицированным геном HER2/neu слабо реагируют на эндокринную терапию, но чувствительны к последующей химиотерапии. Показано, что больным с HER2/neu+ опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии с использованием антрациклинов. Показано, что больным с HER2/neu+ опухолями следует рекомендовать более интенсивные режимы химиотерапии с использованием антрациклинов.

24 Опухоль-ассоциированные протеазы как показатели метастатической и инвазивной активности

25 Рецептор про-uPA + Peц - Про-uPA uPA Плазмин Плазминоген Про-коллагеназа IV др. металлопротеазы Деградация базальной мембраны и внеклеточного матрикса PAI-2 PAI-1 tPA Peц Система активации плазминогена

26 Безрецидивная выживаемость больных раком молочной железы в зависимости от уровня uPA и PAI-1 в опухоли Foekens et al. (2000) исследовали опухоли 2780 больных. Срок наблюдения – до 10 лет. Риск возврата заболевания возрастает в 1,88 раза при высоком уровне uPA в опухоли (>1,21 нг/мг белка). Риск возврата заболевания возрастает в 2,74 при высоком уровне PAI-1 в опухоли (>45,28 нг/мг белка). 1,21 нг/мг белка). Риск возврата заболевания возрастает в 2,74 при высоком уровне PAI-1 в опухоли (>45,28 нг/мг белка).">

27 Доказательная база I уровня: Проспективное рандомизированное кооперированное исследование, включавшее около 600 больных ранними стадиями РМЖ (Janicke et al., 2001) Проспективное рандомизированное кооперированное исследование, включавшее около 600 больных ранними стадиями РМЖ (Janicke et al., 2001) Объединенный многофакторный анализ данных 18 исследовательских групп, включавший в целом 8377 больных (Look et al., 2002) Объединенный многофакторный анализ данных 18 исследовательских групп, включавший в целом 8377 больных (Look et al., 2002) Оба исследования показали, что высокие уровни uPA и PAI-1 являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза, более значимыми, чем размер, степень злокачественности и рецепторный статус опухоли и возраст пациенток. Оба исследования показали, что высокие уровни uPA и PAI-1 являются независимыми факторами неблагоприятного прогноза, более значимыми, чем размер, степень злокачественности и рецепторный статус опухоли и возраст пациенток.

28 Для определения цитозольной концентрации uPA, tPA and PAI-1 использованы наборы для ИФА, разработанные Department of Experimental and Clinical Endocrinology, Academic Hospital St Radboud, University of Nijmegen, the Netherlands. Для определения цитозольной концентрации uPA, tPA and PAI-1 использованы наборы для ИФА, разработанные Department of Experimental and Clinical Endocrinology, Academic Hospital St Radboud, University of Nijmegen, the Netherlands. Обследовано 917 больных злокачественными и доброкачественными опухолями различных локализаций: 102 больных раком молочной железы, 40 больных раком и 82 больных доброкачественными заболеваниями яичников; 58 больных немелкоклеточным раком легкого; 81 больной раком толстой кишки; 97 больных раком желудка; 121 больная раком и 18 больных с гиперпластическими изменениями эндометрия; 44 больных раком пищевода, а также 65 больных опухолями и опухолеподобными поражениями костей различного гистологического строения, 44 больных меланомой и 19 – доброкачественными пигментными заболеваниями кожи, 44 больных раком и 102 пациента с аденомой и другими заболеваниями щитовидной железы. AGAG Ab-1 Ab-2 Ab-3 Аb-4 Пероксидаза хрена Пероксидаза хрена Ab - антитела AG = uPA, PAI-1 или tPA Ab - антитела AG = uPA, PAI-1 или tPA В лаборатории клинической биохимии РОНЦ Показано, что значительное и координированное увеличение содержания uPA и PAI-1 является практически универсальным свойством различных злокачественных опухолей. Соотношение экспрессии компонентов системы активации плазминогена с клинико- морфологическими особенностями и прогнозом заболевания зависит от типа опухоли.

30 Исследования лаборатории клинической биохимии РОНЦ РАМН: Количественными ИФА методами продемонстрировано значительное увеличение экспрессии представителей ключевых подсемейств ММП и ТИМП-1 в опухолях желудочно-кишечного тракта, у больных раком яичников и раком молочной железы. Для некоторых маркеров увеличение экспрессии и/или концентрации в периферической крови было положительно взаимосвязано со степенью местного распространения опухоли или с наличием отдаленных метастазов. В частности, перспективным сывороточным маркером для диагностики и мониторинга рака яичников оказалась ММП-7 (матрилизин): ее уровень повышен относительно контроля у 78% больных, он также коррелирует с ключевыми показателями распространенности рака яичников, а также с уровнем классического сывороточного маркера рака яичников – СА-125. Все это определяет перспективность дальнейших исследований роли ММП и ТИМП как биологических маркеров опухолей различных локализаций, характеризующих их инвазивный и метастатический потенциал.

31 Фактор роста эндотелия сосудов (VEGF) – показатель активности неоангиогенеза.

33 Возможности антиангиогенной терапии (схема J. Folkman) Авастин

34 Прогностическое значение VEGF при раке молочной железы В 13 из 14 работ, опубликованных 8 независимыми группами исследователей, продемонстрировано, что высокая тканевая экспрессия VEGF является независимым фактором неблагоприятного прогноза РМЖ на ранних стадиях и/или его низкой чувствительности к традиционным видам гормоно- или химиотерапии при распространенном процессе. До настоящего времени не доказана возможность использования показателей содержания VEGF в крови (как в сыворотке, так и в плазме) в качестве адекватной замены тканевой экспрессии этого белка при оценке активности ангиогенеза в РМЖ и прогнозировании исхода заболевания.

36 Современные высокотехнологичные возможности исследования биологических маркеров

40 Использование метода ПЦР в режиме реального времени: Мультиплексный ИФА уровня экспрессии белков в лизатах клеток и тканей:

41 Мутационный анализ значимых генов Моноклональные АТ к РЭФР : К препаратам чувствительны только больные колоректальным раком, опухоли которых имеют немутированный (wild-type) ген KRAS. Мутации в 12 и 13 кодонах экзона 2 этого гена, выявляемые у

40% больных, приводят к утрате зависимости роста опухоли от РЭФР. Моноклональные АТ к РЭФР : К препаратам чувствительны только больные колоректальным раком, опухоли которых имеют немутированный (wild-type) ген KRAS. Мутации в 12 и 13 кодонах экзона 2 этого гена, выявляемые у

40% больных, приводят к утрате зависимости роста опухоли от РЭФР. Низкомолекулярные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ РЭФР: Очень незначительная противоопухолевая активность по отношению к большинству опухолей с гиперэкспрессией РЭФР. К препаратам чувствительны только опухоли со специфическими мутациями в тирозинкиназном домене РЭФР (экзон 19 и/или 21), приводящими к его перманентной активации. Соответствующая мутация встречается достаточно редко - преимущественно у больных НМРЛ, никогда не куривших или бросивших курить. Низкомолекулярные ингибиторы рецепторных тирозинкиназ РЭФР: Очень незначительная противоопухолевая активность по отношению к большинству опухолей с гиперэкспрессией РЭФР. К препаратам чувствительны только опухоли со специфическими мутациями в тирозинкиназном домене РЭФР (экзон 19 и/или 21), приводящими к его перманентной активации. Соответствующая мутация встречается достаточно редко - преимущественно у больных НМРЛ, никогда не куривших или бросивших курить.

42 Поиск новых информативных маркеров, характеризующих клинически значимые биологические особенности опухолей. Отбор оптимального набора дополняющих друг друга показателей, позволяющего при минимально возможной стоимости обследования обеспечить максимальную эффективность лечения каждого больного. Использование современных высокопроизводительных технологий (PCR-arrays, PhosphoELISArrays, микрочипы и др.) для комплексного исследования всего спектра маркеров, необходимых для решения конкретной клинической задачи. Перспективы

Рак пищевода (РП) занимает 6 место в структуре онкологической смертности во всем мире. В мире ежегодно регистрируется более 450 тысяч новых случаев рака пищевода и 400 тысяч смертей от этого заболевания [1]. Традиционно выделяют два основных пато-гистологических типа РП: плоскоклеточный рак пищевода (ПРП) и аденокарциному пищевода (АП), которые существенно отличаются по этиологии и географическому распространению, при этом ПРП составляет приблизительно 80 % от всех случаев заболевания [2, 3]. 5-летняя общая выживаемость при ПРП резко падает, если опухоль не диагностирована на ранних стадиях [4]. Плоскоклеточная дисплазия эпителия – признанное предраковое поражение, как правило, не выявляется при простой эндоскопии. После внедрения хромоэндоскопии с раствором Люголя (проба Шиллера) стало возможным обнаружение неокрашенных диспластических участков эпителия [5]. Хромоэндоскопия – дорогостоящий метод, а наличие Люголь-негативного окрашивания воспаленной слизистой оболочки вдоль пищевода компрометирует чувствительность и специфичность, что затрудняет использование методики при скрининге. Поэтому актуальная задача улучшения качества лечения пациентов – поиск предиктивных чувствительных и специфичных маркеров малигнизации тканей пищевода для своевременного проведения лечебных мероприятий.

Теория развития ПРП основана на модели, используемой для других злокачественных заболеваний, описывающей различные стадии прогрессирования опухолевого процесса. После длительного воздействия этиологических факторов происходит неопластическая трансформация эпителиальных клеток слизистой пищевода, которая редко обнаруживается на ранних стадиях. Хирургическое вмешательство является основным методом лечения. Однако у большинства пациентов опухоль выявляется на поздних стадиях, когда, как правило, применяется неоадъювантная химиолучевая терапия с последующим оперативным вмешательством. К сожалению, большинство из них не имеют шансов на долгосрочное выживание. Вмешательство в естественное течение ПРП в качестве первичной профилактики происходит посредством отказа от вредных привычек или снижения интенсивности воздействия основных таких этиологических факторов, как курение и употребление алкоголя; вторичная профилактика может осуществляться в рамках программ скрининга. Далее следуют ранняя диагностика и радикальное хирургическое лечение и, наконец, лечебные мероприятия, обеспечивающие паллиативную помощь хорошего качества [6]. В данном обзоре представлены данные о молекулярных особенностях ПРП и его маркерах, определяющих тактику лечения на разных этапах развития заболевания.

Генетические и эпигенетические изменения при ПРП. Эпидемиологические исследования демонстрируют связь между воздействием канцерогена и раком в человеческой популяции. Специфические канцерогены окружающей среды влияют на спектр генетических, геномных и эпигенетических изменений. Мутации гена опухолевого супрессора ТР53 (р53) являются наиболее частыми генетическими изменениями при ПРП, присутствие которых обнаруживается примерно в 45 % опухолей [11] на ранней стадии опухолевой прогрессии и в окружающей здоровой эпителиальной ткани пищевода [12]. Около половины всех раковых опухолей человека содержат соматические мутации гена ТР53, и уже описано более 15000 мутаций, приводящих к потере функциональной активности данного гена [13]. Анализ спектра мутаций ТР53 полезен в понимании происхождения мутаций и может помочь выявить этиологические факторы, участвующие в возникновении ПРП. Исследования показывают, что распространенность мутаций ТР53 при ПРП варьирует от 35 % до 89 %, в зависимости от географического региона. В Юго-Восточной Бразилии и Юго-Восточной Франции – двух областях со средней заболеваемостью ТР53-мутации наблюдались с частотой около 34 %, и мутационный профиль показал высокий процент изменений в паре оснований А:Т [14]. Считается, что данная разновидность мутации возникает под действием ацетальдегида, первого продукта метаболизма этанола [15], что отражает важную роль алкоголя как фактора риска ПРП. Частота мутаций ТР53 неизменно увеличивается в областях с высокой заболеваемостью, превысив 80 % в Нормандии (Франция) [16], 70 % в Китае [17] и 65 % в Северном Иране [18,19]. Структура мутаций является достаточно сложной и неоднородной, что предполагает многообразие видов и механизмов воздействия, участвующих в инициации и прогрессировании ПРП в районах с высокой заболеваемостью. Отличительной особенностью профиля мутаций ТР53, характерных для ПРП, в географических областях с высокой заболеваемостью, является большая доля изменений CpG-островков. Исследования, проведенные в Иране и Бразилии, показали весьма значительный уровень – 33 % и 18 %, соответственно, G→А замен на CpG участках среди всех мутаций, выявленных в гене ТР53 [18,19]. Замены в CpG сайтах могут быть следствием спонтанного дезаминирования 5-метилцитозина с образованием тимина, а также могут вызываться высоким уровнем оксида азота при хроническом воспалительном процессе [20], который часто присутствует при опухолевом росте [21]. Термическое повреждение хронически раздражает слизистую оболочку пищевода, вызывая воспалительный процесс, и снижает барьерную функцию эпителия к воздействию канцерогенов [22].

В исследовании Sitas F. и соавт. [23] сделано предположение, что инфекция вирусом папилломы человека (ВПЧ) играет этиологическую роль в развитии ПРП. Однако анализ, проведенный на большом количестве пациентов с применением методик, включающих использование таких маркеров, как мутации гена ТР53 и гиперэкспрессия CKI2A (p16), показали, что ВПЧ играет незначительную роль в развитии ПРП [24,25]. Кроме того, в отличие от рака ротоглотки [26], пациенты с ВПЧ положительными плоскоклеточными карциномами пищевода не имеют лучшего прогноза по сравнению с больными с ВПЧ отрицательными опухолями [27].

Обнаружены предиктивные молекулярные маркеры развития ПРП, например SPRP3 (SmallProline-RichProtein 3). Экспрессия SPRP3 индуцируется в процессе дифференцировки эпидермальных кератиноцитов и рассматривается как маркер дифференциации плоскоклеточного эпителия [28,29]. Данное явление особенно ярко выражено в эпителии ротовой полости и пищевода, а изменения в уровне экспрессии мРНК или белка SPRR3, первоначально наблюдаемые в окружающей слизистой оболочке, представляют собой ранние молекулярные события, относящиеся к злокачественной трансформации [30,31].

Кроме генетических аберраций, эпигенетические изменения также вносят важный вклад в развитие ПРП. Эпигенетические изменения происходят на ранних стадиях процесса прогрессирования опухоли, и, следовательно, рассматриваются в качестве потенциальных предиктивных диагностических биомаркеров для ПРП. Несколько исследований сосредоточились на роли изменений паттернов метилирования промоторов определенных генов, участвующих в развитии ПРП. Показано, что промотор гена, кодирующего LMP7 (lowmolecular-massprotein 7), гиперметилированв опухолевой ткани по сравнению с близлежащими нормальными тканями. Отмечено, что паттерны метилирования гена BCL3, способного к активации транскрипции путем ассоциации с NF-kB, и протектора слизистой оболочки TFF1 (trefoilfactor1), нарушаются при плоскоклеточной карциноме и в окружающих здоровых тканях [32]. Еще одна важная эпигенетическая особенность ПРП – распространенное гипометилирование повторов в геноме. Различные исследования продемонстрировали гипометилирование LINE1 (long interspersed nucleotide element 1) при ПРП [32,33]. Хотя профиль метилирования не коррелировал со стадией заболевания [33], S. Iwagami с коллегами [34] показали, что существует корреляция с прогнозом заболевания. Кроме LINE1, при плоскоклеточной карциноме было исследовано состояние статуса метилирования Alu-повторов [35]. В данном исследовании выявлены более низкие уровни метилированияне только в опухолях, но и нормальных образцах эпителия, в сравнении со слизистой оболочкой пищевода у здоровых людей. Полученные результаты позволяют предположить, что гипометилирование Alu-повторов является ранним изменением эпителия пищевода в процессе канцерогенеза.