Молекулярно-генетическое исследование рака легких

Значительные успехи в понимании патогенеза и лечения немелкоклеточного рака легкого (НМРЛ), открытие биологической и терапевтической важности приобретенных генетических изменений в двух генах, кодирующих фармакологически целевые тирозинкиназы рецептора эпидермального фактора роста (EGFR) и киназы анапластической лимфомы (ALK), внесли существенные коррективы в алгоритмы диагностики и, прежде всего, обусловили необходимость обязательного молекулярно-генетического тестирования пациентов.

Целесообразность молекулярно-генетического тестирования опухолей легкого стала очевидной после публикации результатов IPASS – первого рандомизированного исследования, продемонстрировавшего преимущества терапии ингибитором тирозинкиназы (ИТК) EGFR гефитинибом у пациентов с прогрессирующим НМРЛ при наличии мутации EGFR по сравнению со стандартной химиотерапией на основе препаратов платины [1].

Двумя годами ранее, в 2007 году, в исследовании Soda с соавт. [2] было выявлено, что инверсия плеча хромосомы 2p ассоциирована с образованием гена слияния EML4-ALK у больных раком легкого. Он выявляется в 7% случаев НМРЛ. При этом скорость ответа на ингибитор ALK кризотиниб при лечении на протяжении 6,4 мес. составляла 57%, выживаемость без прогрессии, по данным исследования [2], была достигнута у 77% ALK-позитивных пациентов.

Учитывая опубликованные данные о возможностях терапии НМРЛ с мутацией EGFR и быстрый темп работ, открывающих новые горизонты в лечении НМРЛ с транслокацией ALK, три профессиональные организации – Колледж американских патологов CAP, Международная ассоциация по изучению рака легкого IASLC и Ассоциация молекулярной патологии AMP – разработали и опубликовали в 2013 году рекомендации по молекулярному тестированию рака легкого на предмет наличия двух критических предиктивных биомаркеров в клинической практике [3]. В них рассматриваются 5 принципиальных вопросов в отношении молекулярного тестирования НМРЛ:

• Когда должно проводиться молекулярное тестирование?
• Как должно осуществляться молекулярное тестирование на мутацию EGFR?
• Как должно проводиться тестирование транслокации ALK?
• Необходимо ли проводить исследование других генов при аденокарциноме легкого?
• Как необходимо внедрять молекулярное тестирование аденокарциномы на практике?

Согласно рекомендациям [3], молекулярному тестированию на мутацию EGFR и транслокацию ALK подлежит либо первичная опухоль, либо ее метастазы. Исследование показано всем пациентам, у которых опухоль содержит элемент аденокарциномы, независимо от клинических характеристик. Цель молекулярно-генетического тестирования заключается в выделении пациентов для таргетной терапии ингибиторами тирозинкиназы EGFR и ALK.

Исследование мутаций EGFR и транслокации ALK должно проводиться во время диагностики для пациентов с поздней стадией заболевания (IV стадия) или во время рецидива или прогрессии у пациентов с более ранними стадиями, которые не прошли тестирование ранее. Для пациентов I, II и III стадии молекулярно-генетическое тестирование также целесообразно, но решение о его проведении должно приниматься индивидуально [3].

• Метод полимеразной цепной реакции (ПЦР), который отличается высокой скоростью проведения (менее 2 недель, анализу подлежат образцы ткани или крови), применяется для обнаружения мутаций EGFR
• Секвенирование ДНК, в ходе которого исследуется вся длина одного гена на наличие мутации. Имеет более низкую чувствительность по сравнению с другими методами, поскольку для получения корректного результата в образце ткани должно содержаться более 10% клеток опухоли с мутацией. В противном случае тест может быть ложноотрицательным
• Аллель-специфическое ПЦР секвенирование, анализирующее ДНК на наличие аномалий. Позволяет обнаруживать редкие сигналы с большей чувствительностью, чем при прямом секвенировании, к тому же проводится в еще более краткие сроки и имеет более низкую стоимость. Отрицательной стороной является возможность идентифицировать только заранее предопределенные мутации. Используется для скрининга мутаций EGFR, HER2, METex14 и некоторых других, более редких аномалий
• Секвенирование следующего поколения (англ. Next-generation sequencing – NGS) позволяет в краткие сроки проводить количественный анализ редких аллелей и одновременно оценивать множественные гены или даже целые геномы. Сохраняет высокую чувствительность в том числе и при анализе образцов ткани с низким содержанием опухолевых клеток, что предоставляет возможность выявлять новые аномалии, которые невозможно выявить аллель-специфическим тестированием. Недостатком метода является его высокая стоимость. Используется для скрининга мутаций EGFR, HER2, METex14, транслокации ALK
• Флуоресцентная гибридизация in situ, или метод FISH (от англ. fluorescence in situ hybridization), позволяет определить последовательность ДНК на метафазных хромосомах или в интерфазных ядрах in situ. Обычно применяется для обнаружения транслокаций генов и других аномалий, в том числе транслокации ALK
• Иммуногистохимический метод (ICH) представляет собой чувствительный способ определения транслокации ALK, который является более точной альтернативой FISH. Кроме того, позволяет выявить экспрессию белка PD-L1 при НМРЛ

Хотя положительные клинические и рентгенографические ответы пациентов с НМРЛ и мутацией EGFR на терапию ИТК EGFR наблюдаются примерно в 70% случаев [3], у большинства больных возникает рецидив и прогрессирование заболевания через 8-16 месяцев после начала лечения, оправдывая клинический феномен, известный под названием приобретенная резистентность.

Самая частая причина развития приобретенной резистентности, мутация Т790М, по данным исследований, крайне редко обнаруживается в образцах материала пациентов, не получавших лечение [4]. В тех единичных случаях, когда ее удается выявить во время начальной диагностики, целесообразно подтвердить ее соматический или зародышевый статус путем тестирования нормальной ДНК пациента. Зародышевые мутации Т790М ассоциируются с семейным раком легкого, и подтверждение этого факта должно стать основанием для обследования и консультирования членов семьи больного [4].

В отношении исследований других мутаций, служащих основанием для развития приобретенной резистентности к ИТК EGFR, в том числе амплификации МЕТ, и других, более редких аномалий, пока не накоплен достаточный клинический опыт, поэтому для формулировки четких рекомендаций требуются дальнейшие исследования [3].

В настоящее время проводится несколько клинических исследований, изучающих возможности преодоления основных механизмов развития резистентности. Вероятно, в скором времени будут сформулированы дальнейшие рекомендации по определению статуса Т790М и амплификации генов, кодирующих другие рецепторы тирозинкиназ. Более того, статус Т790М может стать важным аспектом при принятии решения о целесообразности продолжения терапии ИТК EGFR в случае развития приобретенной резистентности. С целью ее выявления в подобных случаях может проводиться жидкостная биопсия. Она дает возможность определить генотип менее инвазивным и дорогостоящим способом, чем обычная биопсия. К тому же жидкостная биопсия позволяет контролировать молекулярные особенности рака уже в ходе лечения или прогнозировать рецидив после адъювантной терапии [5].

Согласно рекомендациям NCCN по лечению НМРЛ 2017 года, жидкостная биопсия с целью выявления мутаций, ассоциированных с приобретенной резистентностью к ИТК EGFR, назначается только при невозможности проведения традиционной тканевой биопсии [8].

Принцип жидкостной терапии основан на выявлении молекул, которые часто продуцирует опухоль при НМРЛ, с помощью анализа циркулирующих опухолевых клеток (ЦОК) и/или циркулирующей опухолевой ДНК (цоДНК) [6]. Он может давать информацию о молекулярной эволюции опухоли в процессе терапии.

Ограничение жидкостной биопсии, которая предоставляет возможность предсказывать клинический ответ на таргетные препараты, состоит в достаточно низкой ее чувствительности, которая колеблется в пределах 60-80% [7]. Для жидкостной биопсии характерен высокий риск получения ложноотрицательных результатов по сравнению с традиционной биопсией, обусловленный незначительным и нестабильным количеством цоДНК.

Полученные в последнее время данные свидетельствуют, что пациенты с приобретенной резистентностью к ИТК, ассоциированной с мутацией Т790М, могут получать клиническую пользу, продолжая принимать в качестве препаратов первой линии ИТК EGFR [9].

Выявление мутации EGFR является предиктором чувствительности к ИТК EGFR. В частности, протоколы NCCN рекомендуют назначать пациентам с мутацией EGFR в качестве первой линии терапии эрлотиниб или афатиниб или гефитиниб.

Если мутация выявлена уже после того, как начата химиотерапия, рекомендуется завершить терапию или прервать ее и заменить на ИТК EGFR.

Транслокации ALK могут быть выявлены с помощью FISH, иммуногистохимического анализа, а также большинства панелей секвенирования следующего поколения. Их присутствие ассоциируется с высокой чувствительностью к ингибиторам ALK кризотинибу, церитинибу, алктинибу [8]. Пациентам с положительной транслокацией ALK в качестве терапии первой линии показан кризотиниб или церитиниб. Если аномалия выявлена уже во время химиотерапии, предлагается дополнить ее поддерживающей терапией или прервать, заменив на кризотиниб или церитиниб.

ROS1 представляет собой рецепторную тирозинкиназу, действующую как онкоген у более молодых никогда не курящих пациентов с аденокарциномой. Скрининг транслокации проводится с помощью метода FISH, а также некоторых панелей NGS. Пациенты с транслокацией ROS1 высокочувствительны к терапии кризотинибом[8].

BRAF представляет собой сигнальный медиатор, активирующий митоген-активированную протеинкиназу. Его мутации могут встречаться как в положении экзона 15 V600, так и вне этого домена и обычно ассоциируются с историей курения [10]. Обнаружение аномалии возможно методом секвенирования ПЦР или NGS.

FDA одобрило назначение комбинации дабрафениба и траметиниба пациентам с метастатическим НМРЛ с мутацией BRAF V600E. Также эффективной стратегией, судя по всему, является ингибирование BRAF с помощью низкомолекулярных ИТК вемурафениба и дабрафениба [11].

HER2 относится к семейству рецепторов ТК EGFR. Мутация HER2 может быть выявлена методом ПЦР или секвенирования следующего поколения. Пациенты с мутацией HER2 часто реагируют на HER2-таргетные препараты, в частности, трастузумаб [12], и химиотерапию, а также афатиниб [12].

Применение кризотиниба при амплификации МET и мутациях MET и EGFR изучается [14].

Ген RET кодирует рецептор тирозинкиназы клеточной поверхности. Его транслокации могут выявляться при аденокарциномах, чаще у более молодых пациентов и курильщиков [15], методами FISH или NGS. При выявлении транслокации RET целесообразно назначать RET-ингибиторы, например, кабозантиниб [16], вандетаниб или алектиниб .

У многих пациентов рак легкого выявляется случайно, например, в ходе диагностического обследования при прохождении профилактического осмотра или диспансеризации. Окончательно подтвердить или опровергнуть наличие рака легкого может биопсия выявленного очага. Биопсия – получение материала опухоли или здоровой ткани для последующего микроскопического или молекулярно-генетического изучения.

В зависимости от расположения и размеров опухоли для выполнения биопсии могут быть использованы различные техники:

В зависимости от выраженности распространенности опухолевого процесса рак легкого делится по стадиям. Для стадирования рака легкого используется международная классификация TNM. Для определения стадии заболевания в системе TNM врач оценивает следующие параметры опухоли:

• T (tumor, опухоль) – оценка распространенности первичной опухоли.
• N (nodule, узел) – оценка вовлечения в опухолевый процесс расположенных близко к опухоли лимфатических узлов. N0 означает, что при обследовании не было выявлено вовлечения близлежащих лимфатических узлов, N1-3 – обнаружено вовлечение в опухолевый процесс лимфатических узлов. Большая цифра означает большую степень распространенности опухолевого процесса;
• M (metastasis, метастазы) – оценка наличия отдаленных метастазов опухоли, например, метастатического поражения печени, костей, головного мозга или других органов. M0 означает, что при обследовании не было выявлено наличия отдаленных метастазов, M1 – выявлено вовлечение других органов.

Важно! Стадия заболевания устанавливается один раз – в момент первичной диагностики заболевания и не изменяется в последующем. Это означает, что если у пациента со стадией заболевания T1aN0M0 (IA) через несколько лет после лечения появились метастазы в печени, стадия не изменится на IV, а останется прежней.

Для уточнения стадии заболевания и распространенности опухолевого процесса при раке легкого могут быть использованы различные диагностические методы, включая КТ, ПЭТ-КТ, магнитно-резонансную томографию, сцинтиграфию и другие инструментальные обследования. Это необходимо для определения наилучшей тактики дальнейшего лечения.

Перед началом лечения в обязательном порядке должно проводиться гистологическое и молекулярно-генетическое исследование образца опухолевой ткани.

При оценке послеоперационного материала патолог также изучает как сильно опухоль успела распространиться – имеется ли вовлечение таких анатомических структур, как кровеносные и лимфатические сосуды, поражены ли лимфатические узлы и т.д. В случае необходимости для более точного определения строения опухолевой ткани и происхождения опухоли может быть назначено иммуногистохимическое исследование.

• Активирующие мутации в гене EGFR;
• Структурные перестройки (реарранжировки) в генах ALK и ROS1;
• Наличие и выраженность выработки (экспрессии) белка PD-L1.
• Реже используется определение наличия мутаций в генах BRAF, MET, RET, а также HER2.

Проведение дополнительных исследований может потребовать дополнительное время, но неправильное назначение таргетных препаратов может привести к ухудшению результатов лечения и навредить здоровью пациента.

Немелкоклеточный рак легкого (НМРЛ)

• плоскоклеточный рак (40% больных)
• аденокарцинома (40–50% больных)
• крупноклеточный рак (5–10% больных)

Мелкоклеточный рак легкого (МРЛ)

• МРЛ (15-20% больных)

Таргетная терапия является основой лечения пациентов с НМРЛ. Интенсивное исследование точных молекулярных механизмов рака легких выявило возможность не только избирательно влиять на патологический молекулярный каскад в опухолевой клетке при помощи таргетных препаратов, но также определять эффективность / побочные эффекты классической химиотерапии и давать прогноз развития заболевания и метастатического потенциала опухоли.

Возможность исследования свободноциркулирующей опухолевой ДНК ( технология жидкостной биопсии ) открывает новые горизонты в диагностике, мониторинге и лечении рака легкого.

В последнее время генетическое тестирование позволило выделить подтипы рака легкого с наличием активирующих мутаций в ряде онкогенов. Наибольшее значение имеют мутации в генах EGFR, BRAF, MET и транслокации с участием генов ALK и RET. Нарушения в этих генах являются мишенями для таргетной терапии.

В отличие от химиотерапии, которая убивает любые клетки, включая здоровые, таргетная терапия действует на раковые клетки специфическим образом, точечно на конкретную мишень. Таргетная терапия обладает гораздо меньшим спектром побочных эффектов в сравнении со стандартной химиотерапией.

Клиническое значение исследуемых
генов и возможности таргетной
терапии

Представляем тесты для анализа мутаций, связанных с эффективностю таргетных препаратов

Преимущества метода NGS по сравнению
другими методами для поиска соматических
мутаций в опухоли

ХАРАКТЕРИСТИКА	NGS	ПЦР	СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПО СЭНГЕРУ
Чувствительность (доля мутантного аллеля в образце)	0.1%	1%	15-20%
Возможность определения точных координат мутации	+	-	+
Возможность исследования ранее не описанных мутации	+	-	+
Возможность исследования соматических мутаций в плазме	+	+	-

Панели генов

Панели генов позволяют определить наличие мутаций сразу в нескольких генах, что дает возможность сразу подобрать оптимальное лечение и делают исследование экономически эффективным

Панель для рака легкого базовая

Базовая панель позволяет подобрать лечение таргетными препаратами за короткое время.

Гены входящий в панель: EGFR, BRAF, KRAS, NRAS

• Частота мутаций в гене EGFR при аденокарциноме легкого составляет 25%.
• Мутация L858R и делеции 19 экзона гена EGFR ассоциированы с наибольшим ответом на лечение ингибиторами тирозинкиназ: гефитинибом, эрлотинибом и афатинибом.

• Мутации в гене BRAF встречаются в 4% случаев немелкоклеточного рака легкого.
• Обнаружение мутации в гене позволяет назначить препараты ингибиторы BRAF: вемурафениб и траметиниб.

Мутации в генах KRAS и NRAS обнаруживаются почти у 30% пациентов с немелкоклеточным раком легкого. Наибольшая частота драйверных мутаций обнаруживается в гене KRAS. Мутации в генах KRAS и NRAS чаще всего взаимоисключающие с мутациями в гене EGFR и транслокациями гена ALK.

Базовая панель для рака легкого предоставляет почти половине пациентов с немелкоклеточным раком легкого важную информацию, определяющую дальнейшую тактику диагностики и лечения.

Обнаружение мутаций в генах EGFR и BRAF позволяет назначить пациенту таргетную терапию. В то же время наличие мутации в генах KRAS и NRAS избавляет пациента от дальнейшего поиска транслокаций с участием гена ALK.

Базовая панель выполняется с помощью секвенирования нового поколения (NGS), что позволяет одномоментно диагностировать несколько сотен мутаций по низкой цене.

Стоимость исследования 4 генов методом NGS соответствует стоимости исследования одного гена методом ПЦР, а в ряде случаев даже дешевле.

Вместе с базовой панелью возможно выполнение
исследования на транслокации гена ALK

Исследование транслокаций с участием ген ALK выполняется методом
флуоресцентной гибридизации in situ или FISH методом

• Транслокации с участием гена ALK встречается в 4% случаев НМРЛ. Обнаружение транслокации с участием гена ALK позволяет назначить таргетные препараты, ингибиторы тирозинкиназы ALK кризотиниб, церитиниб.

Панель для рака легкого базовая

Панель для рака легкого базовая
+ транслокации ALK

После установки диагноза рак легкого вас ждет еще несколько важных исследований, среди которых может быть и молекулярно-генетическое. В чем его важность и как проводят этот анализ?

Что такое мутации?

Чтобы понять суть предстоящего вам исследования, придется разобраться, как же так случилось, что нормальная, здоровая клетка вдруг стала злокачественной, способной к неограниченному делению. Напомним, что клетки – это маленькие кирпичики, основная структурная единица в нашем теле. Из них состоят все органы и системы человеческого организма. Клетки имеют различные функции, выполнение которых возложено на органеллы – компоненты, обеспечивающие существование клетки. К ним относится и клеточное ядро, в котором заключен генетический материал, или геном. Он содержит всю биологическую информацию, которая необходима для развития и существования живого организма.

Внутри каждого ядра находится 46 хромосом, по 23 от каждого родителя. Хромосомы содержат множество генов, состоящих из ДНК (дезоксирибонуклеиновой кислоты). Эти гены и контролируют, как работают клетки.

Известны два основных типа генных мутаций:

Известны четыре основных типа генов, вовлеченных в процесс деления клеток, и большинство опухолей имеют дефектные копии более чем одного из них:

Наш организм состоит из более чем ста миллионов миллионов клеток. Рак может начинаться с изменений в одной-единственной из них. Прежде чем нормальная клетка превратится в злокачественную, должно произойти несколько мутаций.

Приобретенные мутации – причина развития так называемого спорадического рака. Они считаются самой распространенной причиной злокачественных новообразований. Наследственные же поломки несут ответственность всего за 5-10% случаев рака.

При раке легкого могут происходить мутации в ряде генов, о которых некоторым из вас придется слышать регулярно.

Таблица. Гены, в которых могут происходить изменения при раке легкого.

Символ	Название гена
EGFR	Рецептор эпидермального фактора роста
ALK	Рецептор тирозинкиназы анапластической лимфомы
KRAS	Вирусный онкогенный гомолог саркомы крыс 2 Кирстен
ROS1	ROS протоонкоген 1, рецептор тирозинкиназы
MET	MET протоонкоген, рецептор тирозинкиназы
ERBB2 (HER2)	Erb2 рецептор тирозинкиназы 2 (также известен как человеческий рецептор эпидермального фактора роста 2)
BRAF	B-Raf протоонкоген, серин/треонин киназа
RET	Ret протоонкоген
FGFR1	Рецептор 1 фактора роста фибробластов

Как вы видите, мутации, которые вызывают рак легкого, могут происходить во множестве генов.

Еще каких-то 15 лет назад онкологам было совершенно неважно, в каком именно геноме произошли трагические изменения, запустившие злокачественный процесс. Однако в нулевых годах от этих данных стало зависеть и дальнейшее лечение рака легкого, и даже течение заболевания.

Когда проводят молекулярно-генетическое тестирование?

Молекулярное исследование опухоли – ключ к пониманию изменений, которые произошли в вашем организме и спровоцировали развитие рака. С его помощью онкологи смогут подобрать тот препарат, который будет максимально эффективно работать именно в вашем случае.

Биопсия чаще всего проводится еще на этапе диагностики. Во время изучения образца тканей врач-паталогоанатом подтверждает наличие в ней опухолевых клеток, определяет тип рака легкого – мелкоклеточный или немелкоклеточный, указывает гистологической тип опухоли (аденокарцинома, плоскоклеточная карцинома и так далее) и проводит молекулярно-генетическое тестирование на наличие мутаций. На основании полученной картины онкологи и составляют дальнейшую схему лечения.

Выявление на фоне таргетной терапии признаков прогрессирования рака свидетельствует о развитии устойчивости. Чаще всего это происходит из-за появления новых мутаций, например, мутации Т790М.

Сегодня молекулярно-генетическое тестирование является неотъемлемой частью комплексной диагностики рака легкого. Его результаты доступны уже через 1-3 недели после забора материала, что позволяет онкологам как можно быстрее приступить к наиболее эффективному лечению рака легкого.

При копировании материалов
ссылка на сайт обязательна.

Определение перестройки гена ALK при раке легкого методом ИГХ – исследование гистологических препаратов биопсийного материала рака легкого, проводимое с использованием меченных флюоресцирующими веществами антител, которое позволяет выявить наличие в опухолевых клетках продукта экспрессии мутированного гена, ответственного за злокачественную трансформацию.

Определение транслокации гена ALK (иммуногистохимический анализ).

ALK Mutation (Gene Rearrangement), EML4-ALK Fusion Protein, ALK (Anaplastic Lymphoma Receptor Tyrosine Kinase) Gene Rearrangement, ALK Gene Fusion.

Какой биоматериал можно использовать для исследования?

Образец ткани, образец ткани в парафиновом блоке.

Как правильно подготовиться к исследованию?

Специальной подготовки не требуется.

Общая информация об исследовании

Современные успехи в лечении онкологических заболеваний во многом связаны с обнаружением молекулярных механизмов возникновения и развития злокачественных новообразований, отличающих их от клеток нормальных тканей, и появлением лекарственных препаратов, способных воздействовать на них. Такие лекарства называются таргетными, то есть действующими на определенную "цель" в опухолевой клетке. Они обладают хорошим профилем безопасности, так как в отличие от стандартной химиотерапии практически не действуют на нормальные ткани, а также характеризуются большей эффективностью. Однако назначение таргетных препаратов возможно лишь при обнаружении в опухолевых клетках специфической мишени для их действия. Сравнительно часто патологическим механизмом злокачественной трансформации клеток является нарушение в так называемых сигнальных путях. Сигнальный путь представляет собой цепь, по которой активирующий сигнал от рецептора, располагающегося на поверхности клетки, через несколько внутриклеточных белков передается в ядро. Такие внутриклеточные белки называются тирозинкиназами, их основная роль – передача сигнала от активированного рецептора путем биохимических реакций.

При немелкоклеточном раке легкого в некоторых случаях причиной злокачественной трансформации клеток может быть перестройка в гене, кодирующем одну из рецепторных тирозинкиназ – ALK (anaplastic lymphoma receptor tyrosine kinase – киназа анапластической лимфомы). В норме активация рецептора сигнального пути, в котором участвует ALK, приводит к пролиферации клеток. В гене ALK зашифрована аминокислотная последовательность как активной части фермента, так и белка-регулятора, который контролирует активность тирозинкиназы. Перестройка в гене приводит к тому, что шифр белка регулятора заменяется на другой – чаще всего кодирующий белок EML4. В результате образуется химерный – сливной – ген EML4-ALK. Белок EML4 способен облегчать белковые взаимодействия, поэтому вследствие генной перестройки ALK попадает под регулирующее влияние EML4, становится независимой от возбуждения своих рецепторов и постоянно посылает пролиферативные сигналы, что приводит к неконтролируемому делению клеток.

Транслокации EML4-ALK в клетках рака легкого были впервые выявлены в 2007 году, а через три года появился таргетный препарат, способный ингибировать активность тирозинкиназы ALK – кризотиниб (ксалкори). Встречаемость перестройки EML4-ALK при раке легкого, по разным данным, колеблется от 3 до 13 %.

Наличие в опухолевых клетках химерной тирозинкиназы может быть выявлено при иммуногистохимическом исследовании биоптата или операционного материала опухоли. Для анализа из готового парафинового блока с помощью специального микроножа нарезают тончайшие срезы, которые затем прикрепляют к предметным стеклам и красят рутинными красителями, чтобы было возможно отличить клетки друг от друга и от межклеточного вещества. Затем срезы на стеклах окрашиваются раствором антител, меченных флюоресцирующими метками, специфичными к мутированной ALK. Если в опухолевой клетке присутствует искомый фермент, антитела связываются с ним и при просмотре стекла под специальным микроскопом можно увидеть флюоресценцию, что будет свидетельствовать о положительном результате теста.

Для чего используется исследование?

• Для выявления показаний к терапии ингибитором ALK кризотинибом.

Когда назначается исследование?

• У пациентов с метастатическим или местнораспространенным немелкоклеточным раком легкого с отсутствием мутации гена EGFR.

Что означают результаты?

Результат выдается с заключением врача.

Положительный результат – обнаружение флюоресценции, свидетельствующее о наличии в клетках продукта экспрессии мутированного гена;

отрицательный результат – отсутствие флюоресценции.

Что может влиять на результат?

Качество предоставленных парафиновых блоков, опыт и квалификация врача-патоморфолога, так как иммуногистохимический метод не в полной мере стандартизирован и оценка его результатов в некоторой степени субъективна.

Несмотря на отсутствие транслокации ALK, пациентам может быть показана терапия кризотинибом – при выявлении транслокации гена ROS1, в ходе которой образуется тирозинкиназа, родственная ALK. Исследование проводится у пациентов с немелкоклеточным раком легкого с отрицательным статусом мутаций EGFR и ALK.

Позитивный и сомнительные результаты иммуногистохимического теста на транслокацию гена ALK обязательно должны быть проверены с помощью молекулярной диагностики – FISH-исследования. При этом кризотиниб может назначаться пациентам с положительным результатом иммуногистохимического исследования без ожидания результатов подтверждающего теста.

• Цитологическое исследование материала, полученного при оперативном вмешательстве
• Цитологическое исследование материала, полученного при эндоскопии (бронхоскопия)
• Гистологическое исследование биопсийного материала
• Гистологическое исследование биоптата лимфатического узла (1 узел) с использованием рутинных методик окраски
• Определение мутации гена EGFR в тканях опухолей
• Определение мутации гена BRAF в тканях опухолей
• Определение перестройки гена ALK при раке легкого методом FISH
• Определение транслокации гена ROS1 при раке легкого

• Отделение анестезиологии и реанимации
• Метастазы рака
• Химиотерапия
• Хоспис для онкологических больных
• Иммунотерапия в центре платной онкологии Медицина 24/7
• КТ-исследования
• МРТ-исследования

• 
  
• 
  
• 
  
• 
  

Успехи современной клинической онкологии неоспоримы. Все более сложные операции, новые препараты, эффективные методы обезболивания и устранения мучительных симптомов. Мы в нашем блоге достаточно рассказывали о том, как сегодня можно продлить и облегчить жизнь пациентам даже на последних стадиях болезни.

Но, тем не менее, тысячи онкологических больных во всем мире ежедневно узнают, что опухоль, которая вчера поддавалась определенному лечению — сегодня снова растет или дает метастазы. Врачи регулярно оказываются в тупике: все положенные лекарства и методы лечения перепробованы, и эффективных для данного пациента — не осталось.

Однако даже из этого тупика можно найти выход. С развитием генетики и молекулярной биологии в руках онкологов оказался новый способ изучить опухоль, чтобы найти в ней уязвимые места.

Для этого используют тестирование — определение особенностей ДНК раковых клеток. Метод сложный технически, дорогой, требует специфических знаний от врача.

Исследование занимает 3 недели, стоит от 250 до 670 т.р. В результате врач получает отчет в 30 страниц сложной информации, которой он еще должен уметь воспользоваться. Но пациентам, которые уже было перестали надеяться, это дает дополнительное время жизни.

Сегодня мы хотим рассказать о том, как делается тестирование, в каких случаях оно может помочь пациенту и какие знания дает врачу.

Мы все — мутанты, это норма. Но некоторые мутации приводят к раку

Для этого все соматические клетки (те, из которых состоит организм), кроме эритроцитов, беспрестанно делятся.

Иногда в процессе деления получаются сбои — мутации. То нить ДНК порвется, то скопируется с ошибкой, то участки хромосом перемешаются. Влиять на это может сотня факторов: от стресса и табачного дыма до воздействия радиации.

Мутации можно разделить на 4 вида

2. Хромосомные аберрации.

Делеция — утрата участка хромосомы. Происходят обрыва концевого участка или разрыва ДНК сразу в двух местах. Всё — этот ген в хромосоме больше не экспрессируется.

Мутации изменяют не только структуру участка ДНК, но и порядок этих участков

Злокачественную клетку от нормальной отличает нарушение клеточного цикла.

Клеточный цикл (жизнь клетки от деления до деления/гибели) строго регулируется работой специальных белков: киназы, циклины, факторы роста и транскрипционные факторы — в каждой живой клетке их десятки, и у каждого своя узкоспециальная, но важная функция.

Каждый этап клеточного цикла контролируется

Таких значимых генов, изменения в которых могут привести к канцерогенезу (возникновению рака) — две больших группы.

Из тех, что наиболее хорошо изучены и у всех на слуху:

• EGFR, ALK, BRAF — немелкоклеточный рак легкого;
• BRAF — меланома;
• HER2 — рак молочной железы (РМЖ);
• KRAS — колоректальный рак.

Причем, мутации этих генов бывают обнаружены при нескольких видах опухолей. Например, повышенная экспрессия HER2 обнаруживается не только при РМЖ, но и при раке легкого и желудка.

Мутация в протоонкогене белка BRAF приводит к неконтролируемому росту опухоли.

опухоли (антионкогены) — напротив, могут подавить рост опухолевых клеток или участвуют в репарации (починке) поврежденной ДНК. А вот инактивация в результате мутации — резко увеличивает вероятность появления злокачественной опухоли.

• мутации BRCA1, BRCA2 — рак молочных желез, яичников;
• мутации p53 — до 50% различных видов раковых опухолей, саркомы;

Всего изучено влияние нескольких десятков протоонкогенов и опухолевых супрессоров на канцерогенез.

Зачем столько сложностей и как они продлевают жизнь пациентам

Иматиниб связывается с активным участком молекулы белка , и блокирует его способность взаимодействовать с остальными молекулами в цепочках сигнальных путей.

Так что таргетные препараты имеют 2 важных преимущества перед классической химиотерапией.

Но и лечение для него должно быть соответствующее — индивидуально подобранное для конкретного пациента — на основе того, что мы определяем мутации в его опухолевых клетках.
В совсем недалеком прошлом злокачественные опухоли можно было классифицировать только по гистологии, то есть в зависимости от того, в каком органе они возникли, и как выглядели раковые клетки под микроскопом.

• узнаем чувствительность опухоли к препаратам;
• выясним, есть ли у опухоли устойчивость к определенным лекарствам;
• обнаружим генетические особенности, которые дают гиперчувствительность к препаратам;
• подберем новое лечение, если опухоль перестала отвечать на стандартную терапию;
• обнаружим опухоль/метастаз на очень ранней стадии — по обрывкам ее ДНК в крови;
• можем прогнозировать благоприятное или агрессивное течение заболевания.

Образцом выступает чаще всего ткань опухоли, либо взятая во время операции по удалению первичного очага, либо биопсия — микроскопический кусочек опухоли берут специальной тонкой длинной иглой.

Можно поискать ДНК опухолевых клеток в крови — тогда нужна так называемая жидкостная биопсия, две пробирки с кровью по 8,5 мл.

При биопсии мы часто сталкиваемся с тем, что многие пациенты боятся вообще трогать опухоль — опасаются, что ее это спровоцирует на рост. На сегодня не доступны исследования, которые бы показали такую взаимосвязь. Конечно, биопсию надо выполнять правильно. У нас чаще всего врачи при заборе биоптата помечают место входа иглы: либо делают маленькую татуировочку (есть и такой инструмент ), либо скобку (хирургическую) ставят. Если потом понадобится операция, они иссекают весь этот ход, где была игла — от кожи до опухоли — так мы делаем шанс распространения раковых клеток за пределы опухоли еще меньше.

Далее образцы отправляются в лабораторию исследований.

Причем применяют сразу несколько методов: секвенирования нового поколения (NGS), секвенирование по Сэнгеру и метод флуоресцентной гибридизации (FISH). Вместе они позволяют прочесть всю последовательность ДНК опухоли, выяснить драйверные мутации — то есть те, которые запустили злокачественный процесс и теперь могут быть мишенью для таргетной терапии — и даже визуализировать весь кариотип (хромосомный набор).

Под стрелкой слева — слияние красного и зеленого сигнала — свидетельство о слияния генетического материала хромосом 9 и 22 с образованием химерной филадельфийской хромосомы.

Кроме того, в полном исследовании обязательно определяют микросателлитную нестабильность (MSI, microsatellite instability) — нарушение в работе механизма репарации ДНК, которые приводят к быстрому накоплению мутаций в клетках. Этот фактор позволяет делать прогноз по поводу дальнейшего течения заболевания.

После получения профиля опухоли — начинается его анализ

Специальные программы обрабатывают полученные результаты и составляют рекомендации автоматически. Но затем эти рекомендации обязательно вручную курируются командой экспертов. В анализе участвуют генетики, биоинформатики, , иммунологи и химиотерапевты. На этом этапе обязательно происходят уточнения и дополнения.

В итоге, в первой части отчета прописаны все найденные мутации в опухоли пациента, и таргетные препараты, которые будут наиболее эффективны в данном случае. Указана таргетная терапия, одобренная для данного типа опухолей с обнаруженными мутациями, и таргетная терапия, которая одобрена для лечения других типов рака с теми же мутациями. У нас в практике были случаи, когда назначались препараты именно второго порядка, — и хорошо действовали.

Далее сотрудники лаборатории проводят огромную работу по мониторингу научных исследований, которые могут быть значимы в случае с данным пациентом.

Во второй части отчета находится обзор существующих на тот момент исследований с подробными данными о частоте встречаемости данной мутации, о действии разных препаратов и о возможности использовать тот или иной вид таргетной терапии при выявленных мутациях. Это помогает составить хотя бы приблизительный прогноз для пациента.

В третьей части отчета собраны актуальные клинические исследования, в которых пациент может принять участие, чтобы получить экспериментальное лечение. Это самый последний запасной способ, но знать о нем все подробности — полезно для спокойствия пациента.

Отчет получается довольно увесистым — 30 страниц захватывающего чтения

Кому это нужно?

В этом случае исследование и дает нам понимание, какой препарат будет эффективен против данной опухоли, именно с этим набором мутаций. Назначение такого препарата позволяет выиграть главный для онкопациента ресурс — время.

Проблемы методики

Опухоли неоднородны. Они состоят из разных клеток, которые могут отличаться весьма значительно. И, например, в 80% клеток опухоли мутация определенного гена присутствует, а 20% клеток поделились с другим распределением хромосом — и остались немутировавшими. Да, мы назначаем препарат по результатам теста, и против 80% опухолевых клеток он сработает эффективно, но для оставшихся 20% нужно будет придумывать другое лечение.

Некоторые виды рака гетерогенны, например, РМЖ. А некоторые опухоли, такие как саркомы, напоминают по структуре винегрет. Это затрудняет и диагностику, и лечение: нельзя заранее узнать, в какой части опухоли какие клетки, сколько их видов, как сильно они отличаются. И нельзя, грубо говоря, взять 10 образцов из разных мест опухоли — по ним придется сделать 10 отдельных генетических исследований.

До 30% таргетных и иммунопрепаратов в России назначается без соответствующего обоснования — без исследований генетики опухоли. И часть этих лекарств оказывается пустой тратой средств бюджета и денег пациента, потому что назначать таргетное лечение без понимания генетики опухоли — это рулетка: зарегистрировано более 600 препаратов. Например, для рака молочной железы есть пять протоколов лечения, в зависимости от мутации гена HER2/Neu.

В западной медицине определение генетического профиля опухоли уже становится стандартом лечения. Для российских онкопациентов тестирования — все еще редкий случай, к сожалению — для бюджетной медицины это пока дорого. Но есть надежда, что все изменится к лучшему. Если сейчас оно стоит 600 тыс. руб., то 5 лет назад стоило больше миллиона — технология становится все проще и совершеннее, а, значит, популярнее и доступнее. Здесь время работает на нас.

Поэтому мало просо сделать генетический тест, нужно уметь понять результаты и сделать верные выводы. Мы с коллегами чаще всего сначала изучаем отчет сами (бывает, приходится посидеть над ним дома, в тишине после работы) — а потом еще и собираем консилиум, принимаем коллегиальное решение.

Но хорошие истории пациентов, честно говоря, всегда мотивируют лучше всего.

Сейчас у нас есть пациентка, 48 лет, с рецидивирующей глиобластомой (агрессивная опухоль мозга). К нам она попала после того, как прошла две линии терапии в государственном онкоцентре. Там все делали правильно, проводили лучевую терапию и назначали таргетный препарат, но опухоль все равно вернулась. Женщине отвели полгода жизни.

Мы предложили ей полное тестирование. Да, оно стоит 600 тыс. рублей, сокращенный вариант, за 250, в ее случае не подошел — нужно было расширенное тестирование, с максимально полным набором мутаций.

Но по результатам обследования назначили ей препарат, который предназначен обычно для лечения немелкоклеточного рака легкого. Он эффективен против опухолей с мутацией EGRF — у нашей пациентки глиобластома была именно с этой мутацией.

Женщина ходит к нам лечиться и наблюдаться уже 4 года. Это в 5 раз дольше, чем при стандартной терапии. Причем, она самостоятельна, живет эти 4 года обычной жизнью, ходит на работу и собирается дождаться внуков.