Микрорнк и рак почки

В.Н. Павлов 1 , И.Р. Гилязова 1,2 , А.А. Измайлов 1 , Е.А. Климентова 2 , И.Р. Султанов 1 , М.А. Бермишева 2 , З.Р. Ахмадеев 2 , А.Х. Нургалиева 3 , Г.В. Ишбулатова 3 , Э.К. Хуснутдинова 1,2,3

Введение

Рак почки (РП) – это гетерогенная группа злокачественных опухолей, подавляющее большинство которых представляют собой почечно-клеточные карциномы различных морфологических типов, но наиболее часто встречается светлоклеточный рак почки (СРП). Особое внимание в канцерогенезе СРП уделяется VHL-HIF1α пути. При нормоксии пролиновые остатки в HIFα гидрокислированы, что делает возможным работу VHL-комплекса и убиквитинилирование HIF1α. HIF участвует в регуляции многих биологических процессов - доставка кислорода и адаптация к его депривации, пролиферация клеток и ангиогенез (через фактор роста эндотелия сосудов (VEGF)), тромбоцитарный фактор роста β (PDGF-β) и трансформирующий рост фактор-α (TGF-α)), метастазирование через подавление E-кадгерина [1, 2]. Нарушения убиквитин-лигазного комплекса приводят к нарастанию концентрации HIF в клетках и приводит к гиперэкспрессии гипоксией-индуцируемых генов, которые участвуют в положительной регуляции клеточной пролиферации и ангиогенезе.

В настоящее время считается, что большую роль в возникновении злокачественных новообразований играют микроРНК – короткие некодирующие РНК длиной 18-25 нуклеотидов, которые взаимодействуют по комплементарному принципу с 3’-нетранслируемыми областями мРНК-мишеней. Согласно имеющимся данным, каждая микроРНК может регулировать сотни различных белок-кодирующих генов [2]. Было показано, что многочисленные гены, участвующие в патогенезе СРП, такие как VHL, PTEN, HIF1-α, mTOR, являются мишенями микроРНК [3]. Изменение характера взаимодействия микроРНК с сайтом связывания в результате однонуклеотидной замены может способствовать изменению экспрессии генов-мишеней, задействованных в возникновении и развитии опухолей.

Целью данного исследования был анализ роли отдельных полиморфных вариантов в сайтах связывания микроРНК (miRNA) генов VHL-HIF1α пути в развитии СРП.

Материалы и методы

Определение генотипов полиморфных локусов сайтов связывания микроРНК в генах VHL-HIFαзависимого пути (rs10982724 гена DEC1, rs406271 гена TFRC, rs10491534 гена TSC1, rs1642742 гена VHL, rs3025033 гена VEGFA) проводили методом аллельной дискриминации Taq-man на приборе CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System. Результаты каждой аллельной дискриминации были проанализированы, используя программное обеспечение CFX96 Touch™ Real-Time PCR Detection System. При попарном сравнении частот генотипов и аллелей в группах больных и здоровых лиц использовался критерий χ2 (Р) для таблиц сопряженности 2х2 с поправкой Йетса на непрерывность.

Результаты

Проведён анализ полиморфных вариантов в генах VHL- HIFα-зависимого пути у пациентов со СРП и в группе здоровых индивидов. Анализ распределения частот аллелей и генотипов по полиморфным локусам rs10982724 гена DEC1, rs406271 гена TFRC, rs3025033 гена VEGFA между пациентами со СРП и здоровыми индивидами не показал каких-либо статистически значимых различий. При сравнительном анализе частот генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1642742 гена VHL было показано, что генотип rs1642742*AA(p=0,0165; OR= 0,5978; 95% CI (0,3915- 0,9213)) встречался у пациентов со СРП в возрасте 55 лет и старше значительно реже, чем в контрольной группе той же возрастной категории, тогда как генотип rs1642742*GG чаще встречался у пациентов, являясь маркёром повышенного риска развития СРП (табл. 1).

Таблица 1. Распределение генотипов и аллелей полиморфного локуса rs1642742 гена VHL в группе пациентов со СРП

Генотипы, аллели	Больные		Контроль		χ2	OR (95%CI)	P-value
	N	pi±Sp, CI%	N	pi±Sp, CI%
Статус курения (положительный) Smoking status (positive)
AA	55	29,73±3,36 (23,25-36,88)	102	41,3±3,13 (35,09-47,71)	5,81	0,59 (0,39-0,91)	0,0165
AG	98	52,97±3,67 (45,51-60,34)	102	41,3±3,13 (35,09-47,71)	5,09	1,58 (1,05-2,36)	0,0244
GG	32	17,3±2,78 (12,14-23,53)	43	17,41±2,41 (12,89-22,72)	0,0005	1,02 (0,60-1,73)	1,0005
A	208	56,22±2,58 (50,99-61,34)	306	61,94±2,18 (57,5-66,24)	2,95	0,77 (0,58-1,03)	0,0858
G	162	43,78±2,58 (38,66-49,01)	188	38,06±2,18 (33,76-42,5)	2,95	1,28 (0,96-1,70)	0,0858
Возраст (старше 55 лет)
Генотипы, аллели	Больные		Контроль		χ2	OR (95%CI)	P-value
AA	79	34,5±3,14 (28,36-41,04)	82	46,86±3,77 (39,29-54,53)	5,81	0,3915-0,9213	0,0165
AG	102	44,54±3,28 (37,99-51,23)	71	40,57±3,71 (33,23-48,24)	0,36	0,759-1,756	0,5748
GG	48	20,96±2,69 (15,88-26,81)	22	12,57±2,51 (8,05±18,41)	4,30	1,0324-3,3142	0,0381
A	260	56,77±2,31 (52,09-61,36)	235	67,14±2,51 (61,95-72,04)	8,56	0,4763-0,868	0,0043
G	198	43,23±2,31 (38,64-47,91)	115	32,86±2,51 (27,96-38,05)	8,56	1,1532-2,1019	0,0043

Кроме того, проведён анализ полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1. TSC1 – ген, кодирующий белок туберозного склероза гамартин – ключевой интегратор сигналинга ростовых факторов. Белок TSC1 подавляет рост и пролиферацию клеток, ингибируя мишень комплекс рапамицина 1 в клетках млекопитающих.

При сравнении группы больных с учётом тяжести течения заболевания были выявлены статистически значимые различия в распределении частот аллелей и генотипов полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1 (табл. 2).

Таблица 2. Распределение генотипов и аллелей полиморфного локуса rs10491534 гена TSC1 в группе пациентов со СРП тяжёлого течения и в контроле

Генотипы, аллели	Больные		Контроль		χ2	OR (95%CI)	P-value
	N	pi±Sp, CI%	N	pi±Sp, CI%
Статус курения (положительный) Smoking status (positive)
CC	3	1,45±0,83 (0,3-4,18)	2	0,41±0,29 (0,05-1,47)	0,99	3.58 (0.48-3.79)	0.319
CT	53	25,6±3,03 (19,81-32,12)	87	17,76±1,73 (14,47-21,43)	5,10	1,59 (1.06-2.39)	0.024
TT	151	72,95±3,09 (66,35-78,87)	401	81,84±1,74 (78,13-85,15)	6,45	0,59 (0.40-0.89)	0.011
C	59	14,25±1,72 (11,03-17,99)	91	9,29±0,93 (7,54-11,28)	6,96	1,62 (1.12-2.33)	0.009
T	355	85,75±1,72 (82,01-88,97)	889	90,71±0,93 (88,72-92,46)	6,96	0,61 (0.42-0.88)	0.009

Обсуждение

В результате проведённого анализа наиболее значимые ассоциации были выявлены для полиморфных локусов, расположенных в генах VHL и TSC1. Одним из важных генов-супрессоров опухолевого роста, инактивируемых при светлоклеточном раке почки (СРП) является ген фон Хиппеля-Линдау (VHL, von Hippel–Lindau), локализованный на коротком плече хромосомы 3 в области 3p25-3p26. Основной функцией белка VHL является регуляция индуцируемого гипоксией фактора α (HIF-1α) путём образования комплекса, обладающего E3 -убиквитин-лигазной активностью. Moore L.E. et al. показали, что полиморфный вариант rs1642742 гена VHL был связан с риском гиперметилирования VHL-промотора [4]. Случаи СРП с конкретными полиморфизмами зародышевой линии VHL с большей вероятностью имели инактивацию VHL посредством гиперметилирования промотора, чем путем изменения последовательности ДНК в опухолевой ткани. Таким образом, можно предположить, что присутствие этих SNP может представлять собой пример облегченной эпигенетической вариации (унаследованной склонности к эпигенетической вариации) в ткани почки. Мы показали значительно повышенный риск развития СРП у носителей аллеля rs1642742*G в возрасте 55 лет и старше. Такие же результаты были представлены в исследовании Wen-Chung Wang et al., где частота аллеля G в rs1642742 была намного выше при поздних стадиях карциномы почек у пациентов из Тайваня [5].

Гены туберозного склероза TSC1 и TSC2 действуют совместно для ингибирования сигнального пути mTOR. Этот универсальный для многих клеток организма путь отвечает за процессы клеточного роста, пролиферации, дифференциации, обладая онкогенной активностью. Известно, что нарушения пути mTOR путём гиперэкспрессии или структурных нарушений генов, входящих в сигнальный путь, может приводить к злокачественной трансформации клеток [6]. В исследовании Wei H et al. не было показано статистически значимых ассоциаций полиморфного варианта rs10491534 с риском развития СРП [2]. Также было показано, что полиморфный вариант rs10491534 гена TSC1 играет важную роль в модулировании риска развития вторичных опухолей / рецидивов [7].

Выводы

Полученные в результате настоящего исследования данные свидетельствуют об ассоциации полиморфных вариантов сайтов связывания микроРНК с риском развития рака почки, а также тяжестью течения заболевания. Вместе с другими известными эпидемиологическими, клиническими и генетическими факторами выявленные генетические маркёры могут способствовать выявлению лиц с высоким риском развития рака почки тяжёлого течения. Однако, необходимы дальнейшие исследования изученных генов на независимых выборках для установления их функциональной значимости и роли в патогенезе злокачественных новообразований почки.

Литература

1. Zhang J, Zhang Q. VHL and Hypoxia Signaling: Beyond HIF in Cancer. Biomedicines. 2018;6(1),35. DOI: 10.3390/biomedicines6010035
2. Wei H, Ke H-L, Lin J, Shete S, Wood CG, Hildebrandt MA. MiRNA target site polymorphisms in the VHL-HIF1α pathway predict renal cell carcinoma risk. Molecular carcinogenesis. 2014;53(1):1-7. DOI: 10.1002/mc.21917
3. Chow TF, Youssef YM, Lianidou E, Romaschin AD, Honey RJ, Stewart R, Pace KT, Yousef GM. Diff erential expression profi ling of miRNAs and their potential involvement in renal cell carcinoma pathogenesis. Clinical Biochemistry. 2010;43(1- 2):150-158. DOI: 10.1016/j.clinbiochem.2009.07.020
4. Moore LE, Nickerson ML, Brennan P, Toro JR, Jaeger E, Rinsky J, Han SS, Zaridze D, Matveev V, Janout V, Kollarova H, Bencko V, Navratilova M, Szeszenia-Dabrowska N, Mates D, Schmidt LS, Lenz P, Karami S, Linehan WM, Merino M, Chanock S, Boff eƩ a P, Chow WH, Waldman FM, Rothman N. Von Hippel-Lindau (VHL) Inactivation in Sporadic Clear Cell Renal Cancer: Associations with Germline VHL Polymorphisms and Etiologic Risk Factors. PLОS Genet. 2011;7(10):e1002312. DOI: 10.1371/journal.pgen.1002312
5. Wang WC, Tsou MH, Chen HJ, Hsu WF, Lai YC. Two single nucleotide polymorphism sinthe von Hippel-Lindau tumor suppressor gene in Taiwanese with renal cell carcinoma. BMC Research Notes. 2014;7:638. DOI: 10.1186/1756-0500- 7-638
6. Mehta MS, Vazquez A, Kulkarni DA, Kerrigan JE, Atwal G, Metsugi S, Toppmeyer DL, Levine AJ, Hirshfi eld KM. Polymorphic variants in TSC1 and TSC2 and their association with breast cancer phenotypes. Breast cancer research and treatment. 2011;125(3):861-868. DOI: 10.1007/s10549- 010-1062-1.
7. Hildebrandt MAT, Lippman SM, Etzel CJ, Kim E, Lee JJ, Khuri FR, Spitz MR, Lotan R, Hong WK, Wu X. Genetic variants in the PI3K/PTEN/AKT/MTOR pathway predict head and neck cancer patient second primary tumor/recurrence risk and response to retinoid chemoprevention. Clinical Cancer Research. 2012;18(13):3705-3713. DOI: 10.1158/1078- 0432.CCR-11-3271

Статья опубликована в журнале "Вестник урологии" № 4 2018, стр. 36-41

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Логинов В.И., Береснева Е.В., Казубская Т.П., Брага Э.А., Карпухин А.В.

Введение. Светлоклеточный почечно-клеточный рак почки (скПКР) характеризуется высокой частотой (30–40 %) случаев летальных исходов, которая при метастазировании достигает 90 %. Отсутствие эффективной диагностики на ранних стадиях заболевания указывает на необходимость поиска новых маркеров скПКР.Цель работы – определение роли метилирования группы генов супрессорных микроРНК (миРНК) в патогенезе и прогрессировании скПКР и идентификация маркеров для диагностики скПКР и прогноза метастазирования .Материалы и методы. Методом бисульфитной конверсии ДНК с последующей метилспецифичной полимеразной цепной реакцией определено изменение статуса метилирования 10 генов миРНК в образцах ДНК опухоли и парных гистологически неизмененных тканях 70 больных скПКР, а также в образцах ДНК тканей почки 19 умерших от неонкологических заболеваний. Метилирование генов MIR-107, -130b и -148a при скПКР в данной работе исследовано впервые.Результаты. Показано, что 8 генов миРНК (MIR-9-1/3, -34b/c, -124a-1/2/3, -129-2, -130b) метилированы в опухолях скПКР с достоверно более высокой частотой, чем в парной гистологически неизмененной ткани почки. Установлена значимая связь метилирования 4 генов миРНК (MIR-107, -124a-3, -129-2, -130b) с показателями прогрессирования скПКР (стадия, размер опухоли, степень дифференцировки), в том числе для генов MIR-107 и -129-2 – с метастазированием в лимфатические узлы или отдаленные органы. Связь метилирования генов MIR-107 и -130b с прогрессированием заболевания показана впервые. Составлены потенциальные системы маркеров для диагностики скПКР на основе биопсийного материала; по данным ROC-анализа 2 системы маркеров из 4 и 5 генов (MIR-9-1, -34b/c, -124a-3, -129-2; и с добавлением MIR-130b) характеризуются клинической чувствительностью 90 % и специфичностью 94 % (площадь под ROC-кривой 0,93 и 0,94 соответственно).Заключение. Полученные результаты в дальнейшем лягут в основу разработки метода неинвазивной диагностики скПКР. Таким образом, показана связь метилирования ряда генов миРНК с патогенезом и прогрессированием скПКР и их потенциальное диагностическое значение.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Логинов В.И., Береснева Е.В., Казубская Т.П., Брага Э.А., Карпухин А.В.

Methylation of 10 miRNA genes in clear cell renal cell carcinoma and their diagnostic value

Introduction. Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is characterized by the high (30–40 % of cases) frequency of lethal outcomes which at metastasis reaches 90 %. Lack of efficient diagnostics at early stages of a disease indicates the need of searching on new ccRCC markers.Objective: for definition of methylation role of some tumor suppressor microRNA (miRNA) genes in ccRCC pathogenesis and progression and marker identification for ccRCC diagnostics and metastasis predictions.Materials and methods. The alterations of methylation status of 10 miRNA genes were determined by methylation specific polymerase chain reaction in tumor DNA samples and matched histologically unchanged tissues from 70 patients with ccRCC, as well as in DNA samples of kidney tissues from 19 post-mortal individuals without cancer history. Methylation of MIR MIR-107, -130b and -148a genes in ccRCC was studied for the first time.Results. It was shown that 8 miRNA genes (MIR-9-1/3, -34b/c, -124a-1/2/3, -129-2, -130b) were methylated in ccRCC tumors with significantly higher frequency than in the matched histologically unchanged kidney tissues. It was established the association of methylation of 4 miRNA genes (MIR-107, -124a-3, -129-2, -130b) with ccRCC progression (stage, tumor size, differentiation grade), including metastasis in the lymph nodes or distant organs, revealed for MIR-107 and -129-2. The association of MIR-107 and -130b methylation with progression of ccRCC is shown for the first time. Potential marker systems are made for ccRCC diagnostics using tumor biopsy; according to the ROC analysis, systems from 4 and 5 genes (MIR-9-1, -4b/c, -124a-3, -129-2/with addition of MIR-130b) are characterized by high clinical sensitivity of 90 % and specificity of 94 % (area under ROC curve 0.93 and 0.94). Conclusion. The received results will form the basis of noninvasive ccRCC diagnostics further development. To conclude, it is shown the association of methylation of 9 miRNA genes with ccRCC pathogenesis and progression and its potential diagnostic value.

Метилирование 10 генов микроРНК при светлоклеточном раке почки и их диагностическое значение

В.И. Логинов1, 2, Е.В. Береснева3, Т.П. Казубская4, Э.А. Брага1, 2, А.В. Карпухин1

Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 23 и

Введение. Светлоклеточный почечно-клеточный рак почки (скПКР) характеризуется высокой частотой (30—40 %) случаев ле- "" тальных исходов, которая при метастазировании достигает 90 %. Отсутствие эффективной диагностики на ранних стадиях заболевания указывает на необходимость поиска новых маркеров скПКР.

Цель работы — определение роли метилирования группы генов супрессорных микроРНК (миРНК) в патогенезе и прогрессировании скПКР и идентификация маркеров для диагностики скПКР и прогноза метастазирования.

Материалы и методы. Методом бисульфитной конверсии ДНК с последующей метилспецифичной полимеразной цепной реакцией определено изменение статуса метилирования 10 генов миРНК в образцах ДНК опухоли и парных гистологически неизмененных тканях 70 больных скПКР, а также в образцах ДНК тканей почки 19 умерших от неонкологических заболеваний. Метилирование генов MIR-107, -130b и -148a при скПКР в данной работе исследовано впервые.

Результаты. Показано, что 8 генов миРНК (MIR-9-1/3, -34b/c, -124a-1/2/3, -129-2, -130b) метилированы в опухолях скПКР с достоверно более высокой частотой, чем в парной гистологически неизмененной ткани почки. Установлена значимая связь метилирования 4 генов миРНК (MIR-107, -124a-3, -129-2, -130b) с показателями прогрессирования скПКР (стадия, размер опухоли, степень дифференцировки), в том числе для генов MIR-107 и -129-2 — с метастазированием в лимфатические узлы или отдаленные органы. Связь метилирования генов MIR-107 и -130b с прогрессированием заболевания показана впервые. Составлены потенциальные системы маркеров для диагностики скПКР на основе биопсийного материала; по данным ROC-анализа 2 системы маркеров из 4 и 5 генов (MIR-9-1, -34b/c, -124a-3, -129-2; и с добавлением MIR-130b) характеризуются клинической чувствительностью 90 % и специфичностью 94 % (площадь под ROC-кривой 0,93 и 0,94 соответственно).

Заключение. Полученные результаты в дальнейшем лягут в основу разработки метода неинвазивной диагностики скПКР. Таким образом, показана связь метилирования ряда генов миРНК с патогенезом и прогрессированием скПКР и их потенциальное диагностическое значение.

Ключевые слова: светлоклеточный почечно-клеточныйрак, метилирование, ген микроРНК, метастазирование, система маркеров DOI: 10.17650/1726-9776-2017-13-3-27-33

Methylation of 10 miRNA genes in clear cell renal cell carcinoma and their diagnostic value V.I. Loginov1,2, E. V. Beresneva3, T.P. Kazubskaya4, E.A. Braga1,2, A. V. Karpukhin1

Research Center for Medical Genetics; 1 Moskvorech'e St., Moscow 115478, Russia; 2Institute of General Pathology and Pathophysiology; 8 Baltiyskaya St., Moscow 125315, Russia; 3State Research Institute for Genetics and Selection of Industrial Microorganisms; 1 Pervyy Dorozhnyy Proezd, 117545 Moscow, Russia; 4N.N. Blokhin National Medical Research Oncology Center, Ministry of Health of Russia; 23 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia

Introduction. Clear cell renal cell carcinoma (ccRCC) is characterized by the high (30—40 % of cases) frequency of lethal outcomes which at metastasis reaches 90 %. Lack of efficient diagnostics at early stages of a disease indicates the need of searching on new ccRCC markers. Objective: for definition of methylation role of some tumor suppressor microRNA (miRNA) genes in ccRCC pathogenesis and progression and marker identification for ccRCC diagnostics and metastasis predictions.

Materials and methods. The alterations of methylation status of 10 miRNA genes were determined by methylation specific polymerase chain reaction in tumor DNA samples and matched histologically unchanged tissues from 70 patients with ccRCC, as well as in DNA samples of kidney tissues from 19 post-mortal individuals without cancer history. Methylation of MIR MIR-107, -130b and -148a genes in ccRCC was studied for the first time.

Results. It was shown that 8 miRNA genes (MIR-9-1/3, -34b/c, -124a-1/2/3, -129-2, -130b) were methylated in ccRCC tumors with significantly higher frequency than in the matched histologically unchanged kidney tissues. It was established the association of methylation

of 4 miRNA genes (MIR-107, -124a-3, -129-2, -130b) with ccRCCprogression (stage, tumor size, differentiation grade), including metastasis in the lymph nodes or distant organs, revealed for MIR-107 and -129-2. The association of MIR-107 and -130b methylation with progression of ccRCC is shown for the first time. Potential marker systems are made for ccRCC diagnostics using tumor biopsy; according to the ROC analysis, systems from 4 and 5 genes (MIR-9-1, -4b/c, -124a-3, -129-2/with addition of MIR-130b) are characterized by high clinical sensitivity of 90 % and sspecificity of 94 % (area under ROC curve 0.93 and 0.94).

Conclusion. The received results will form the basis of noninvasive ccRCC diagnostics further development. To conclude, it is shown the association of methylation of 9 miRNA genes with ccRCC pathogenesis and progression and its potential diagnostic value.

Key words: clear cell renal cell carcinoma, methylation, microRNA gene, metastasis, marker system

u Не можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Гиперметилирование СрО-островков промотор -ных областей белоккодирующих генов, обладающих свойствами супрессоров опухолевого роста, часто выявляется в злокачественных опухолях и ассоциировано с подавлением экспрессии этих генов [6]. Гиперметилирование таких генов рассматривается как один из факторов развития опухоли и маркер раннего выявления онкологического заболевания.

МикроРНК (миРНК) — класс однонитевых неко-дирующих РНК длиной 19—25 нуклеотидов, участвует в регуляции белоккодирующих генов на посттранскрипционном уровне. Гены миРНК так же подвержены метилированию, как и гены, кодирующие белки [7]. Предполагается, что доля генов миРНК, регулируемых посредством метилирования СрО-островков, в 5—10 раз выше, чем структурных генов [8]. Гиперметилирование, инактивирующее гены супрессорных миРНК, выявлено как в гематологических, так и в солидных видах рака, включая острую миелоидную лейкемию, меланомы, рак легкого, толстой кишки,

желудка, молочной железы и др. [9, 10]. Как показано ранее, в том числе авторами данной работы, профили гиперметилирования генов миРНК могут использоваться как потенциальные биомаркеры для диагностики и прогноза течения разных видов рака [11—14]. При этом анализ гиперметилирования генов миРНК при скПКР представлен единичными публикациями [14—16].

Цель исследования — определение профиля метилирования 10 генов супрессорных миРНК при скПКР с использованием представительной выборки образцов и оценка диагностических и прогностических характеристик гиперметилированных генов миРНК.

Материалы и методы

Бисульфитную конверсию ДНК и метилспецифич-ную полимеразную цепную реакцию (МС-ПЦР) проводили, как описано ранее [18]. Праймеры и условия МС-ПЦР для исследуемых фрагментов генов миРНК взяты из [15, 19—21]. Для каждого гена анализировали от 3 до 6 CpG-динуклеотидов. МС-ПЦР выполняли на амплификаторе T100 Thermal Cycler (Bio-Rad, США) по программе: 1 цикл 95 °С, 5 мин; 35 циклов <95 °С, 10 с; температура отжига, 20 с; 72 °С, 30 с>; 1 цикл 72 °С, 3 мин. Ложноположительные результаты из-за неполной бисульфитной конверсии ДНК исключали на стадии подбора праймеров по отсутствию продукта МС-ПЦР на необработанной бисульфитом

Таблица 1. Обобщенные данные по клиническим характеристикам больных светлоклеточным почечно-клеточным раком почки (n = 70) Table 1. Pooled data on clinical characteristics of patients with clear cell renal cell carcinoma (n = 70)

КЛИМЕНТОВА Е.А., ГИЛЯЗОВА И.Р., КУНСБАЕВА Г.Б., СУЛТАНОВ И.М., ИЗМАЙЛОВ А.А., ПАВЛОВ В.Н., ХУСНУТДИНОВА Э.К.

ИНСТИТУТ БИОХИМИИ И ГЕНЕТИКИ УФИМСКОГО НАУЧНОГО ЦЕНТРА РОССИЙСКОЙ АКАДЕМИИ НАУК, Г. УФА

Цель: Провести анализ экспрессии 758 зрелых микроРНК в опухолевой ткани почки и нормальной почечной паренхиме пациентов со светлоклеточным раком почки.

Результаты: Проведенный анализ экспрессии 758 микроРНК у пациентов с раком почки после введения поправки на множественность (FDR) выявил всего 2 дифференциально экспрессирующихся микроРНК между нормальной почечной паренхимой и опухолевой тканью почки светлоклеточного гистологического варианта – miR-210 и miR-642. Для валидации данных, полученных при массовом скрининге микроРНК, была собрана отдельная независимая группа пациентов, отобраны образцы тканей (15 образцов нормальной и 15 образцов опухолевой ткани почки) и проведен анализ экспрессии микроРНК-210 и микроРНК-642. В результате такого анализа обнаружен статистически значимый высокий уровень экспрессии микроРНК-210 в опухолях почки (M±SEM: 3,48±0,159) по сравнению с нормальной почечной паренхимой (M±SEM: 2,6±0,253).

Обсуждение: Исследования последних лет демонстрируют влияние тканевой гипоксии на экспрессию miR-210. МикроРНК-210 (miR-210) является наиболее часто активируемой микроРНК в нескольких раковых клеточных линиях в условиях гипоксии. Она активируется во многих типах опухолей, предположительно, из-за гипоксического характера опухолей, поскольку нарушенный ангиогенез не способен поддерживать адекватное кровоснабжение при развитии заболевания. Опухолевая гипоксия коррелирует с худшим ответом на лучевую и химиотерапию, неблагоприятным исходом. Кроме того, при изучении метастатического рака почки показано, что снижение экспрессии микроРНК-210 способствует уменьшению миграции и инвазии опухолевых клеток.

Выводы: Полученные данные позволяют предположить, что изменение экспрессии генов микроРНК может вносить вклад в генетическую предрасположенность рака почки и служить диагностическим маркером развития данного заболевания.

ИЗУЧЕНИЕ ОБРАЗОВАНИЯ МУЛЬТИМОЛЕКУЛЯРНЫХ КОМПЛЕКСОВ ДРОЖЖЕВОГО БЕЛКА NHP6 СО СВОБОДНОЙ И НУКЛЕОСОМНОЙ ДНК

КОЗЛОВА А.Л., ГЕРАСИМОВА Н.С., ВАЛИЕВА М.Е., СТУДИТСКИЙ В.М.

МГУ ИМ.М.В.ЛОМОНОСОВА, МОСКВА

Цель: Nhp6 – это небольшой белок дрожжей с молекулярной массой 10,81 кДа, неспецифично связывающий ДНК. Этот белок присутствует в большом количестве в ядре дрожжей и входит в состав нескольких комплексов (к примеру, комплекса FACT), взаимодействующих с хроматином и играющих жизненно важную роль в метаболизме клетки. Однако механизм взаимодействия Nhp6 с нуклеосомой в биологических процессах до сих пор недостаточно изучен. Целью работы было выяснить, отличается ли связывание Nhp6 со свободным фрагментом ДНК длиной 282 п.н. и с собранной на нём мононуклеосомой.

Методы: Исследуемые ДНК-фрагменты были получены методом полимеразной цепной реакции и очищены в агарозном геле. В ходе ступенчатого диализа против растворов с понижающейся ионной силой в присутствии донорного хроматина на них были собраны мононуклеосомы. ДНК или нуклеосомы инкубировали в различных условиях в присутствии разных количеств белка Nhp6, образование ДНК-белковых комплексов наблюдали за счет сдвига электрофоретической (ЭФ) подвижности в нативном полиакриламидном геле (ПААГ).

Результаты: В нашей работе мы получили ДНК, содержащую высокоаффинную к гистонам последовательность нуклеотидов 603 для посадки нуклеосомы и промоторный участок для транскрипции in vitro модельной РНК-полимеразой E. сoli. Мы определили, что при взаимодействии Nhp6 с одним и тем же фрагментом ДНК в свободном и связанном с гистоновым октамером виде наблюдается формирование одинакового количества комплексов, отличающихся по ЭФ подвижности в нативном ПААГ. При постепенном повышении концентрации белка было выявлено последовательное образование восьми мультимолекулярных комплексов. Каждый такой комплекс состоит из одного ДНК-содержащего субстрата и некоторого количества молекул Nhp6. При образовании восьмого комплекса наблюдается насыщение связывания, причем в случае свободной ДНК это происходит при меньшей концентрации белка. Кроме того, было показано, что при повышении ионной силы раствора образование мультимолекулярных комплексов проходит более эффективно, чем при низкой ионной силе, и, как следствие, насыщение комплекса происходит при более низких концентрациях.

Обсуждение: Методом наблюдения за ЭФ подвижностью ДНК-белковых комплексов в нативном ПААГ мы определили, нуклеосомная организация не влияет на количество молекул Nhp6, которые могут связаться с ДНК. Из данных литературы известно, что белок Nhp6 связывается с участком ДНК длиной 10-15 п.н.. Поскольку в среднем на молекулу Nhp6 приходилось 35 п.н., скорее всего, молекулы Nhp6 могут одновременно связываться только на некотором расстоянии друг от друга вдоль спирали ДНК.

Выводы:1. Как свободная, так и нуклеосомальная ДНК длиной 282 п.н. образуют с белком Nhp6 восемь комплексов, отличающихся по подвижности в нативном ПААГ. 2. В среднем на один связанный комплекс Nhp6 с ДНК приходилось 35 п.н. 3. Нуклеосомная организация снижает сродство Nhp6 к ДНК.

Последнее изменение этой страницы: 2017-02-19; Нарушение авторского права страницы