Клетки рака молочной железы mcf-7

Конкурирующие интересы: авторы заявили, что конкурирующих интересов не существует.

Задуманные и разработанные эксперименты: JLD VG HV. Выполняли эксперименты: HV VG JLD. Проанализированы данные: HV VG JLD FG. Написал документ: HV VG JLD FG. Выполнены in vivo эксперименты и статистический анализ: HV JLD.

Муцин MUC5B имеет критическую защитную функцию в нормальных легких, слюнных железах, пищеводе и желчном пузыре, и, как сообщается, аберрантно выражается в раке молочной железы, второй ведущей причиной смертей от рака среди женщин во всем мире. Чтобы лучше понять влияние MUC5B на патогенез рака, просветную линию клеток MCF7 рака молочной железы человека трансфицировали вектором, кодирующим рекомбинантный мини-муцин MUC5B, и затем заражали вирусом для доставки короткой шпилечной РНК, чтобы сбить мини- муцин. Пролиферативные и инвазивные свойства в Matrigel субклонов и субпопуляций MCF7 оценивали in vitro. Модель ксенотрансплантата была установлена ​​путем подкожной инокуляции клонов MCF7 и субпопуляций у мышей SCID. Измеряли рост опухоли, а опухоли и метастазы оценивали гистологическим и иммунологическим анализом. Мини-муцин MUC5B способствовал пролиферации и инвазии клеток MCF7 in vitro. Эксперименты ксенотрансплантата показали, что мини-муцин способствует росту опухоли и распространению клеток MCF7. В заключение, экспрессия MUC5B связана с агрессивным поведением MCF7 клеток рака молочной железы. Это исследование показывает, что MUC5B может представлять собой хорошую мишень для замедления роста опухоли и метастазов.

Муцины представляют собой высокомолекулярные O-гликозилированные белки, присутствующие на поверхности большинства эпителиальных клеток. Человеческие муцины классифицируются структурно в два семейства: связанные с мембраной муцины (MUC1, MUC3A / B, MUC4, MUC12, MUC13, MUC16 и MUC17) и секретируемые или гелеобразующие / полимеризующиеся муцины (MUC2, MUC5AC, MUC5B, MUC6 и MUC19) [1] — [3]. Секретируемые муцины включают амино- и карбокси-концевые области, которые разделяют сходные домены с коэффициентом про-фон Виллебранда. Эти муцины полимеризуются через эти области с образованием длинных полимеров, которые секретируются в просвете многих органов. Центральная часть муцинов содержит большие области, обогащенные гидроксиаминокислотами и пролинами (Ser / Thr / Pro), которые широко замещены O-гликанами. Эти последовательности Ser / Thr / Pro различаются по размеру и последовательно между муцинами, не сохраняются между видами и обычно организованы в тандемных повторах (TR). Во многих полимеризующихся муцинах эти тандемно повторяющиеся последовательности связаны или прерываются голой и гидрофобной областью, богатой остатками цистеина и называемой CYS-доменом [4].

Мы широко охарактеризовали структуру гена MUC5B человека [5] — [7]. Центральная часть MUC5B состоит из трех чередующихся поддоменов: (i) субдомен по имени R, найденный пять раз и выполненный из повторений нерегулярного повторения 29 аминокислот (aa), богатых Ser, Thr и Pro; (ii) сохраняющийся субдомен 111aa, называемый доменом R-конца, и найденный четыре раза; и (iii) высококонсервативный домен, названный CYS-доменом [4], который составляет около 110 а.о. и обнаружен семь раз в белке MUC5B. Переменный домен CYS / R-домен / R-конец создает большую составную повторную единицу 528 aa [6].

Рак молочной железы является второй ведущей причиной смертей от рака у женщин во всем мире [8]. Мюцин MUC1, связанный с мембраной, является наиболее изученным муцином при раке молочной железы [9] и является наиболее широко изученным муцином для разработки терапии для лечения рака молочной железы [8]. Среди четырех полимеризующихся муцинов MUC2, MUC5B, MUC5AC и MUC6, чья измененная экспрессия была зарегистрирована в тканях рака молочной железы, роль MUC5B плохо документирована. Только несколько исследований были сосредоточены на MUC5B. Муцин был обнаружен иммуногистохимией в первичных опухолях молочной железы (81%) и в образцах нормального появляющегося грудного эпителия, прилегающих к раковым клеткам (42,1%), тогда как MUC5B не был обнаружен в нормальных контрольных образцах молочной железы [10]. MUC5B-мРНК-транскрипты были обнаружены в аспиратах костного мозга 9/46 пациентов (19,5%), которые подверглись первичной резекции опухоли [11], но не в 36 образцах образцов нормальной периферической крови, что указывает на то, что MUC5B может быть специфическим маркером с высокой специфичностью ( 100%) для диагностики распространения рака молочной железы [10], [11]. Чтобы проанализировать роль MUC5B в опухолегенезе молочной железы, мы трансфицировали линию клеток опухоли молочной железы MCF7 [12] с помощью плазмиды, кодирующей муцин MIN-MUC5B, сделанный из большой составной единицы MUC5B со многими O-гликозилированными сайтами и окруженный двумя доменами CYS , Мы обнаружили, что мини-муцин MUC5B способствует клеточной пролиферации и in vitro инвазии опухолевых клеток рака молочной железы. Используя модель мышиной иммунодефицитной мыши, мы показываем, что MUC5B способствует росту опухоли и метастазированию. Эти данные свидетельствуют о том, что MUC5B представляет собой хорошую терапевтическую мишень для замедления роста опухоли и распространения рака молочной железы.

(A) Схематическое представление управляющих векторов Ires-Luc и Mini5B-Luc. Вставка, кодирующая Mini5B, была выполнена с помощью сигнальной последовательности, 11 TR 29 aa, одного R-конца домена 111 aa и двух доменов CYS 110 aa. (B) Используя анализ активности люциферазы, были получены четыре стабильных клона, экспрессирующих трансген Ires-Luc (клоны B2, C5, C7 и C10) и два стабильных клона, экспрессирующих трансген Mini5B-Luc (клоны A3 и D6). (C) экспрессию мРНК MUC5B изучали с помощью qRT-PCR (TaqMan) в линии родительских клеток MCF7 (белая коробка), в клонировании IRE-Luc (MCF7) и в клон Mini5B-Luc (черный ящик). Уровни экспрессии были нормированы на уровни мРНК 18S и показаны как x-fold относительно нормализованной экспрессии гена MUC5B в родительских клетках MCF7. Относительные количества генов-мишеней рассчитывали с использованием метода ΔΔCt. Значения — это среднее ± стандартное отклонение от четырех до шести независимых образцов. (D) MUC5B иммунофлюоресцентный анализ родительских клеток MCF7, клоны Ires-Luc и Mini5B-Luc. Mini5B был секретирован на клеточной поверхности клонов Mini5B-Luc. Ядра были противопоставлены йодидом пропидия. Шкала шкалы 50 мкм. (E) Выражение Mini5B оценивали с помощью RT-PCR. Продукт ПЦР 159 п.о. был обнаружен только в клон Mini5B-Luc. (F) Вестерн-блот-анализ лизатов из клонов Ires-Luc, клонов Mini5B-Luc и субпопуляции Mini5B-Luc CYS shRNA. (G) Было определено количественно ингибирование продукции Mini5B, обнаруженное путем Вестерн-блоттинга. Производство Mini5B клона Mini5B-Luc было установлено на уровне 100, а производство Ires-Luc было установлено на уровне 0.

Клеточная линия MCF7 рака молочной железы человека была приобретена в Американской коллекции типовых культур (ATCC HTB22, полученной из аденокарциномы молочной железы человека). Клетки поддерживали в минимальной существенной среде (MEM) (технологии Invitrogen / Life, Villebon-sur-Yvette, Франция), дополненной 2 мМ l-глутамина, 1,5 г / л бикарбоната натрия, 0,1 мМ несущественного аа, 1 мМ пирувата натрия, 0,01 мг / мл бычьего инсулина и 10% фетальной бычьей сыворотки (Thermo Scientific) при 37 ° С в увлажненной атмосфере с 5% СО2.

(A) Кривые роста клонов Mini5B-Luc и Ires-Luc. Данные выражаются как среднее ± SEM. Кривая представляет собой три эксперимента. Для двух клонов было рассчитано удвоение времени. (B) Инвазивные проценты клонов Ires-Luc и Mini5B-Luc и популяции Mini5B-Luc KD. Данные выражаются как среднее ± SEM. Диаграмма представляет собой два эксперимента. (C) Иллюстрация окклюзионных клеток, окрашенных толуидиновым синим. Шкала шкалы 50 мкм.

IRES-Luc (отмеченная в дальнейшем Ires-Luc) кассета, фланкированная двумя сайтами рестрикции EcoRI, была получена путем двухступенчатой ​​ПЦР-амплификации и субклонирована в вектор pCR4 (Invitrogen) с использованием pMG (InvivoGen, Тулуза, Франция) и pGL3 Basic ( Promega, Leiden, The Netherlands) в качестве шаблонов. Люк-последовательность 1,7 т.п.н. амплифицировали с использованием двух олигонуклеотидных последовательностей 5′-AGATCTTACGCGTGCTAGCC-3 ‘(вперед) и 5′-GGATCCGACTCTAGAATTACAC-3′ (обратный), вводящих соответственно BglII и сайт рестрикции BamHI (подчеркнутый). Последовательность Ires 0,7 т.п.н. амплифицировали с использованием двух олигонуклеотидных последовательностей 5’-GAATTCGAACGTAGCTCTAG-3 ‘(вперед) и 5′-AGATCTCCTACCGGTGATCTC-3’ (обратного), введя соответственно сайт рестрикции EcoRI и BglII (подчеркнутый). Использовался пустой эукариотический вектор pcMG и pcMG, несущий последовательность mini5B [13]. Плазмида pcMG является производным плазмиды pcDNA3.1, но промотор был заменен композиционным промотором EF1α-HTLV из pMG и содержит небольшой интрон. Последовательность Mini5B составлена ​​из лигирующей цепи IgK в кадре с двумя идентичными доменами CYS MUC5B, фланкирующими большой участок Ser / Thr / Pro (430 аа) муцина. Кассета EcoRI-EcoRI-Ires-Luc объемом 2,5 кб была субклонирована в уникальный сайт рестрикции EcoRI pcMG или в pcMG-Mini5B, расположенный ниже по потоку от стоп-кодона Mini5B. Использовались только векторы с правильной ориентацией кассеты (pcMG-Ires-Luc и pcMG-Mini5B-Ires-Luc). Mini5B содержит в своей карбокси-концевой последовательности N-гликозилирующий сайт NSS.

(A) Окрашивание ОН проводили на парафиновых срезах печени, легких и лимфатических узлах мышей, которым вводили клоны Mini5B-Luc. Метастаз показан в увеличенном изображении. (B) Иммунофлуоресцентный анализ проводили на парафиновых срезах печени у мышей, которым вводили клоны Mini5B-Luc и окрашивали анти-PCNA-антителом. Метастатические клетки были положительными. (C). Двойной иммунофлуоресцентный анализ с использованием антител против человеческого E-кадгерина и антител против MUC5B проводили на парафиновых срезах грудных лимфатических узлов у мышей, которым вводили клоны Mini5B-Luc. Метастатические клетки экспрессировали как эпителиальный маркер E-cadherin, так и секретируемый белок MUC5B. Ядра были контрастированы с Hoechst 33258 или йодидом пропидия. Mt, метастазы. Шкала шкалы 50 мкм.

Клетки MCF7 трансфицировали с использованием набора Effectene (Qiagen, Courtaboeuf, France) с 2 мкг плазмиды pcMG-Mini5B-Ires-Luc или pcMG-Ires-Luc (Luc clone), линеаризованной с помощью уникального рестрикционного фермента SspI. Трансфицированные клетки затем отбирали с помощью аналога неомицина G418 (650 мкг / мл, Invitrogen) в течение 10 дней через ген устойчивости к неомицину вектора pcMG. Клоны, устойчивые к G418, отбирали индивидуально и высевали в 96-луночный планшет для культивирования, расширивали в 48-луночный планшет, затем шестизонный планшет и, наконец, в культуральной колбе на 25 см2.

(A) Mini5B-Luc, Ires-Luc, пурпурная shRNA Mini5B-Luc или ксенотрансплантаты SHRNA Mini5B-Luc CYS. Рост опухоли контролировался один раз в неделю в течение 118 дней. * P 2 мм в наибольшем размере) наблюдались в легких у одной мыши в группе Ires-Luc и у 4/4 мышей в группе Mini5B-Luc (рис.5C и таблица 1) , Напротив, только одна мышь в группе SHRNA Mini5B-Luc CYS показала метастазы в печени (таблица 1). Индекс тяжести заболевания был выше у мышей, которым вводили клетки, экспрессирующие Mini5B (клоны Mini5B-Luc и пустые популяции SH5NA Mini5B-Luc), чем у мышей, которым вводили клетки, которые не экспрессировали группы Mini5B (Ires-Luc и Mini5B-Luc CYS shRNA, P = 0,002) (фиг.6). Эти доклинические данные свидетельствуют о том, что мини-муцин Mini5B способствует росту опухоли и распространению клеток в этой модели s.c. ксенографты.

В физиологических условиях муцины играют защитную роль в эпителиальных тканях и участвуют в процессе эпителиальной дифференциации, регуляции роста, модуляции клеточной адгезии и клеточной передачи сигналов [22]. Многочисленные исследования показали, что аномальное гликозилирование муцина обычно связано со злокачественной трансформацией эпителиальных клеток [9], [23]. Сверхэкспрессия муцинов, наблюдаемая во многих раковых образованиях, важна для адгезии и инвазии раковых клеток, выхода из раковых клеток из иммунной системы, захвата биологических молекул, таких как факторы роста и роста клеток [22].

При некоторых раковых заболеваниях наблюдалась несостоятельная или эктопическая экспрессия муцинов. Это имеет место для MUC5B, который выражается ненормально в желудочных карциноматозных тканях и клеточных линиях [24] и в аденокарциномах легких [25], [26]. В ткани молочной железы белок MUC5B обнаруживается с высокой частотой в тканях рака молочной железы, тогда как муцин не экспрессируется в нормальных контрольных образцах молочной железы [10]. Ранее сообщалось, что все опухоли молочной железы развиваются спонтанно в трансгенном штамме мыши MMTV-ras, продуцированном Muc5b [27]. Среди рака молочной железы люминальный подтип составляет 68% всех случаев рака молочной железы и связан с высоким риском (70%) для развития метастазов [28]. Клеточная линия MCF7, экспрессирующая E-кадгерин, рецептор эстрогена и рецептор прогестерона, считается хорошей моделью для имитации рака молочной железы [29]. Чтобы далее понять последствия MUC5B в патогенезе рака молочной железы, мы трансфицировали клетки MCF7 рекомбинантным мини-муцином MUC5B, и мы оценили инвазивный и метастатический потенциал этих клеток in vitro и s.c. ксенотрансплантата.

Прогнозируемый транскрипт MUC5B составляет 17,9 кб в длину [5] — [7], [24] в соответствии с экспериментами с нозерн-блоттингом [30]. Центральный экзон MUC5B имеет длину 10713 bp и кодирует пептид 3571 aa, состоящий из семи доменов CYS и областей, богатых Ser / Thr / Pro, из муцина, которые несут многочисленные олигосахаридные цепи. Большой размер пептидного фрагмента MUC5B (> 5000 аа) заставил нас исследовать его роль in vitro и in vivo, используя мини-муцин, сделанный из области, специфичной для домена, 650 аа, что является репрезентативным для центральной области полный O-гликозилированный муцин. Ранее было показано, что этот мини-муцин выделяется как N-гликозилированные и экстенсивно O-гликозилированные молекулы, когда вектор трансфицируется в клетках COS-7 [13].

Мы обнаружили, что мини-муцин способствовал пролиферации клеток MCF7 in vitro и инвазии в Матригеле. Эксперименты ксенотрансплантата показали, что мини-муцин, продуцируемый клетками MCF7, заметно влияет на рост опухоли и связан с агрессивным поведением опухоли. Этот вывод согласуется с предыдущими исследованиями о роли другого гелеобразующего муцина MUC2 в раке молочной железы [31] — [33]. Одно исследование показало, что клеточная линия рака толстой кишки LSLiM6 секретирует MUC2, который при инокуляции мышам индуцирует метастазы в печени [34]. Уменьшение экспрессии MUC2 с помощью антисмысловой стратегии ингибирования уменьшало способность клеток колонизировать этот орган.

Сравнение частоты развития опухоли и метастазов между мышами, инъецированными клоном Ires-Luc, и мышами, инъецированными клоном SHRNA Mini5B-Ires-Luc CYS, говорит о том, что лучший результат был для группы SHRNA Mini5B-Ires-Luc CYS. Это удивительно, поскольку мы ожидали подобных результатов для этих двух групп. В то время как экспрессия эндогенного MUC5B казалась весьма схожей между клонами и родительской клеточной линией на уровне гена и уровнем белка, мы не можем полностью исключить, что экспрессия MUC5B дикого типа, которая не должна ингибироваться в клоне Ires-Luc, может быть частично ответственным за наблюдаемые различия.

Функция полимеризации муцинов в биологии рака молочной железы неясна, и механизмы, с помощью которых экспрессия муцина влияет на опухолегенез раковых клеток молочной железы, плохо изучены. Влияние экспрессии муцина на поведение раковых клеток может различаться в зависимости от клеточной линии и изученного муцина. Было высказано предположение, что избыточная экспрессия MUC6-доменов муцина ингибирует инвазию раковых клеток in vitro
[35], тогда как в некоторых случаях экспрессия этого секретируемого муцина, по-видимому, коррелирует со степенью гистопатологии, которая связана со злокачественным потенциалом [36].

Вполне вероятно, что экспрессия и аномальное гликозилирование нашего мини-муцина в клетках MCF7 приводит к модуляции клеточных и клеточных матричных взаимодействий, что облегчает инвазию клеток MCF7. Было показано, что с использованием двух линий MCF7 и T47D рака молочной железы тандемы повторения MUC6 являются хорошими кандидатами на высокую плотность общего антигена Tn, связанного с раком человека, обнаруженного в этих клеточных линиях [37]. Поэтому мы можем предположить, что избыточная экспрессия тандемных повторов MUC5B в клетках MCF7 может способствовать более высокой экспрессии антигена Tn. Аномальное гликозилирование MUC2 в клетках LSLiM6 обнажает антигены Tn и sialyl Lex на поверхности опухолевых клеток [34], и эти гликановые эпитопы важны при адгезионных взаимодействиях с базальной мембраной и сосудистым эндотелием путем связывания E-селектина, который способствует метастазированию [23 ], [34].

В заключение, сверхэкспрессия MUC5B в раковых клетках MCF7 может стимулировать агрессивное поведение опухолевых клеток за счет увеличения клеточной пролиферации, роста опухоли и распространения. Наше исследование предполагает, что разработка вакцин, направленных против аномально гликозилированных доменов MUC5B, должна оцениваться на предмет рака молочной железы.

Цена:

Авторы работы:

Научный журнал:

Год выхода:

МОЛЕКУЛЯРНАЯ БИОЛОГИЯ, 2015, том 49, № 2, с. 279-288

СРАВНИТЕЛЬНЫЙ АНАЛИЗ ТРАНСКРИПТОМОВ КЛЕТОЧНЫХ ЛИНИЙ

РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА MCF-7 И MDA-MB-435 С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ТЕХНОЛОГИИ ВЫСОКОПРОИЗВОДИТЕЛЬНОГО

Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes, Institute of Life and Health Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China Поступила в редакцию 09.06.2014 г.

Принята в печать 28.06.2014 г.

Профили транскриптомов клеточных линий рака молочной железы человека MCF-7 и MDA-MB-435 исследовали с использованием технологии высокопроизводительного секвенирования RNA-Seq. Для скрининга дифференциально экспрессирующихся транскриптов использован пакет программ DESeq. Всего выявлено 229 генов со значимо различающейся экспрессией в клетках MDA-MB-435 по сравнению с клетками MCF-7. Аннотирование биологических функций через Базу данных для аннотации, визуализации и интегрированного обнаружения (DAVID v6.7) позволило выявить, что эти 229 дифференциально экспрессирующихся генов главным образом вовлечены в биологические функции, связанные с клеточной адгезией и движением, процессингом и презентацией антигенов (через MHC класса II), гормональным ответом, организацией внеклеточных структур, ремоделированием тканей и регулированием пролиферации клеток. При анализе индивидуальных генов выявлено, что по сравнению с MCF-7 у клеток MDA-MB-435 выше способность к метастазированию, а также к процессингу и презентации антигенов, и снижена способность к гормональному ответу. Двадцать наиболее представленных транскриптов в клетках MDA-MB-435, такие как VIM, TNC и CD74, ассоциируются с высоким метастатическим потенциалом. Помимо генов, которые, как ранее сообщалось, вовлечены в метастазирование и развитие опухолей, вновь идентифицированные в этом исследовании гены могут послужить основой для выработки нового подхода в вопросах диагностики и прогнозирования агрессивного рака молочной железы.

Keywords: MCF-7, MDA-MB-435, RNA-Seq, высокопроизводительное секвенирование, рак молочной железы, метастазы.

TRANSCRIPTOME ANALYSIS OF HUMAN BREAST CANCER CELL LINES MCF-7 AND MDA-MB-435 BY RNA-Seq, by C. H. Wang*, X. J. Gao*, S. G. Liao, J. X. Feng, B. Luo, L. X. Liu* (Key Laboratory of Functional Protein Research of Guangdong Higher Education Institutes, Institute of Life and Health Engineering, Jinan University, Guangzhou 510632, China; *E-mail: langxialiu@gmail.com, tliulx@jnu.edu.cn). The transcrip-tomic profiles of human breast cancer cell lines MCF-7 and MDA-MB-435 were investigated using the next-generation RNA sequencing (RNA-Seq). The DESeq package was used to screen the differentially expressed transcripts. A total of229 genes with a significantly differential expression in MDA-MB-435 cells as compared with MCF-7 cells were obtained. Annotation of the biological functions of these genes through the Database for Annotation, Visualization and Integrated Discovery (DAVID ) v6.7 demonstrated that the 229 differentially expressed genes were mainly implicated in the biological functions related to cell adhesion and motion, antigen processing and presentation (via MHC class II), hormone response, extracellular structure organization, tissue remodeling, and cell proliferation regulation. Analysis of the individual genes demonstrated that MDA-MB-435 cells exhibited a higher tendency to metastasis and antigen processing and presentation, and lower ability to hormone response. Twenty most abundant transcripts in MDA-MB-435 cells, such as VIM, TNC, and CD74, represent its high potential for metastasis. Besides the genes previously reported to be involved in tumor metastasis and development, genes newly identified in this study could provide new clues for the diagnosis and prognosis of aggressive breast cancers.

Keywords: MCF-7 cells, MDA-MB-435 cells, RNA-Seq, tumor metastasis. DOI: 10.7868/S0026898415020159

^ Вклад этих авторов равнозначен.

# Статья представлена авторами на английском языке.

* Эл. почта: langxialiu@gmail.com, tliulx@jnu.edu.cn

Стабильный фенотип и генотип клеточных линий рака молочной железы позволяют использовать эти клетки как эффективную модель для изучения механизмов опухолегенеза и оценки эффективности терапии [1]. Клеточные линии рака молочной железы MCF-7 и MDA-MB-435 общеизвестны и широко используются при изучении роста, регуля-торных механизмов и терапии опухолей молочной железы. Клеточная линия рака молочной железы MCF-7 относится к гормонально активным и получена из плеврального выпота пациента с метастатическим раком молочной железы [2]. Позитивная на рецептор эстрогена клеточная линия MCF-7 с низкой локальной инвазивностью считается практически "неметастатичной" [3] и, как обнаружено, "более дифференцированной" [4]. В то же время клеточная линия MDA-MB-435 высоко агрессивна, для нее характерен высокий метастатический потенциал и значительно более низкий уровень диф-ференцировки [3, 5]. Клеточная линия MDA-MB-435 получена из плеврального выпота пациента с раком молочной железы в конце 1970-х [6] и с тех пор используется как клеточная линия рака молочной железы во многих исследованиях. В течение последнего десятилетия не утихают споры о происхождении человеческих клеток MDA-MB-435: из клеток рака молочной железы или меланомы M14 — из-за перекрестного загрязнения клеточных культур на ранней стадии пролиферации [7]. Чэмберс (Chambers) [8] утверждал, что клеточная линия MDA-MB-435, экспрессирующая как эпителиальные, так и меланоцитные маркеры, — низкодифференцированная опухолевая линия агрессивного рака молочной железы. Многие клеточные линии можно, действительно, рассматривать как линии с "неверной родословной" (''lineage infidelity''). Например, в некоторых сообщениях показано, что опухоли молочной железы могут коэкспрессировать эпителиальные и меланоцитные маркеры [9, 10]. Недавно сообщалось о "неверной родословной" 100 образцов опухолей молочной железы, зачастую экспрессирующих маркеры меланоцитов [11]. Холлестел и Шутт (Hollestelle & Schutte) [12] рассматривали MDA-MB-435 как клеточную линию рака молочной железы базального типа, но не люминального. Совсем недавно Нерлих и Бахмайер (Nerlich & Bachmeier) сообщили о том, что эпителиальные/мам-милярные и меланоцитарные характеристики клеток MDA-MB-435 зависят от плотности клеток [5]. При низкой плотности клеток MDA-MB-435 проявляются их эпителиальные характеристики, а при высокой они экспрессируют маркеры меланоцитов. Это означает, что MDA-MB-435 действительно клеточная линии рака молочной железы эпителиального происхождения [5].

Технология высокопроизводительного секве-нирования RNA-Seq привлекает все больше внимания при широкомасштабных исследованиях

транскриптомов. Ее использование позволяет беспристрастно (гипотетически нейтрально) анализировать экспрессию как известных, так и новых транскриптов с высоким разрешением [13]. Более того, до сих пор не изучен полный профиль тран-скриптома клеток MDA-MB-435. В этом исследовании, используя RNA-Seq, мы сравнили дифференциальные транскриптомы клеток MCF-7 и MDA-MB-435 и получили новые доказательства высокой метастатической активности и других агрессивных особенностей, присущих клеткам MDA-MB-435, а также идентифицировали потенциальные маркеры для прогноза и диагностики рака молочной железы базального типа.

Клеточные линии. Линии клеток рака молочной железы человека,MCF-7 и MDA-MB-435, которые были получены из Центра клеточных ресурсов Института наук о жизни Китайской академии наук (Cell Resource Center, Institute of Life Science, Chinese Academy of Sciences, Шанхай, Китай), культивировали в модифицированной среде (DMEM, "Gibco BRL", США) с 10% телячьей эмбриональной сыворотки (FBS, "PAA Laboratories", Австрия), 1% пенициллин/стрептомицин ("Genom", Китай) при 37°C во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2.

Подготовка образцов РНК. Суммарную РНК экстрагировали из клеточных линий MCF-7 и MDA-MB-435, используя Trizol ("Invitrogen") и колонки RNeasy spin ("Qiagen", Германия). Примеси геномной ДНК удаляли с использованием набора DNA-free kit ("Ambion", США). Полученные образцы РНК проанализировали электрофорезом в ага-розном геле и препараты высокого качества отправили в Шанхайскую биотехнологическую корпора-цияю (Shanghai Biotechnology Corporation, Шанхай, Китай) для конструирования библиотеки секвени-рования на платформе Illumina Genome Analyzer IIx System (single-end sequence). Данные РНК-секвени-рования (RNA-seq) доступны в базе данных Gene Expression Omnibus (номер доступа GSE54122).

Конструирование библиотек для секвенирова-ния. Подготовку библиотек для секвенирования проводили в Шанхайской биотехнологической корпорации (Шанхай, Китай) с использованием набора Illumina's TruSeq RNA Sample Preparation Kit ("Illumina"), как описано ранее [14]. Вкратце: суммарную мРНК обогащали полиA+мРНК с помощью гранул для очистки РНК (RNA Purification Beads, "Illumina"), фрагментировали путем инкубации со смесью Elute-Prime-Fragment Mix для получения вставок 120—200 п.н., транскрибировали в кДНК с помощью обратной транскриптазы SuperScript II Reverse Transcriptase ("Invitrogen") и получали двухцепочечные продукты с использованием набора Second Strand Master Mix ("Invitrogen"). По-

сле этого дцДНК обогащали с помощью Ampure XP Beads("Beckman Coulter", Китай), лигировали адапторы по поли(А) и амплифицировали 12-цик-ловой ПЦР. Количественный анализ библиотек проводили на флуориметре Qubit® 2.0 ("Invitrogen") и валидировали, используя биоанализатор Agilent 2 100 ("Agilent", Китай). Кластеры продуцировали с помощью Illuminac Bot для библиотеки в концентрации 10 пМ.

Анализ последовательностей. Необработанные чтения картировали по референс-последо-вательности мРНК человека (RefSeq) для GRCh37/hg19, загруженной с браузера UCSC Genome (http://hgdownload.cse.ucsc.edu/downloads, доступен с 21.01.2013), используя к

Для дальнейшего прочтения статьи необходимо приобрести полный текст. Статьи высылаются в формате PDF на указанную при оплате почту. Время доставки составляет менее 10 минут. Стоимость одной статьи — 150 рублей.

• РАЗЛИЧИЯ В АПОПТОТИЧЕСКОМ ОТВЕТЕ ЛИНИЙ КЛЕТОК MCF-7 И MDA-MB-231 РАКА МОЛОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ЧЕЛОВЕКА, ЗАРАЖЕННЫХ РЕКОМБИНАНТНЫМ АДЕНОВИРУСОМ, СОДЕРЖАЩИМ ГЕН VP2 ВИРУСА ИНФЕКЦИОННОЙ БОЛЕЗНИ БУРСЫ

MOHD-AZMI MOHD LILA, SHEIKH-OMAR ABDUL RAHMAN, TAN SEOK SHIN, ZEENATHUL NAZARIAH ALLAUDIN — 2014 г.

Исследователи из США изучили взаимодействие клеток рака молочной железы и иммунных NK-клеток и обнаружили, что опухоль способна перепрограммировать NK-клетки, заставляя их помогать опухоли. Ученые описали молекулярный механизм этого процесса и предложили способы блокировать его. Это может послужить основой для новых методов борьбы с метастазами.

Органоид опухоли (показан синим) окружен NK-клетками (красные).
Credit: Isaac Chan, M.D. | Пресс-релиз

Натуральные киллеры (NK-клетки) играют важную роль в борьбе с метастазами злокачественных новообразований.

Чтобы выяснить, каким образом клетки рака молочной железы (РМЖ) избегают атаки NK-клеток, ученые из США провели эксперименты на exvivo культурах и invitro моделях метастазирования. Они использовали клетки мышиной опухоли молочной железы, экспрессирующие кератин 14 (К14) с флуоресцентной меткой, так как известно, что K14 + -клетки РМЖ особенно инвазивны. В то же время, уровень экспрессии K14 имеет отрицательную корреляцию с уровнем экспрессии молекул MHC-1, что делает эти клетки уязвимыми для NK-клеток.

Активность образования метастазов проверяли в invitro моделях по формированию колоний в питательной среде. Культивирование в присутствии NK-клеток, выделенных от мышей ликого типа, на 70% снижало эффективность образования колоний, при этом наблюдалась апоптотическая гибель клеток опухоли. Однако после 36–48 часов совместной инкубации атака NK-клетками опухолевой культуры прекращалась. Ученые предположили, что клетки РМЖ перепрограммируют NK-клетки, делая их неопасными.

Чтобы проверить эту гипотезу, они выделили NK-клетки у мышей с РМЖ (авторы называют их tumor exposed NK, teNK) и посмотрели, будут ли teNK подавлять формирование колоний клетками опухоли. Оказалось, что teNK не ограничивали инвазию опухоли, а наоборот, способствовали формированию колоний. Такой же эффект наблюдали при использовании мышиных NK, выделенных из опухолевого инфильтрата. Наконец, эффект был подтвержден в опытах с человеческими NK-клетками и клеточной линией РМЖ MCF-7.

Чтобы определить молекулярный механизм этого феномена, ученые провели РНК-секевенирование NK-клеток мышей дикого типа и teNK. Сигнатура генной экспрессии в teNK была схожа с таковой у покоящихся NK. В частности, в teNK возрастал уровень экспрессии рецептора KLRG1 — ингибитора функций NK и рецептора TIGIT. Блокировка этих рецепторов с помощью антител нейтрализовало действие teNK в совместной культуре с клетками РМЖ и уменьшало интенсивность формирования колоний опухолевыми клетками.

Кроме того, в teNK возрастала экспрессия нескольких ДНК-метилтрансфераз. Обработка teNK ингибиторами ДНК-метилтрансфераз перед добавлением их к культуре РМЖ предотвращало стимулирующее воздействие teNK на опухоль и приводило к снижению уровней KLRG1 и TIGIT.

Isaac S. Chan, et al. // Cancer cells educate natural killer cells to a metastasis-promoting cell state. // Journal of Cell Biology (2020) 219 (9): e202001134; DOI: 10.1083/jcb.202001134