Иммунофенотип при лимфоцитарных и пролимфоцитарных злокачественных лимфомах

Иммунофенотип

Одной из основных черт анапластической крупноклеточной лимфомы (АККЛ) является экспрессия CD30 (КМ)-молекулы. CD30 является 120 kDa трансмембранным цитокиновым рецептором из семейства рецепторов фактора некроза опухоли TNF), для которого был установлен лиганд (CD30L).

Растворимая 85 kDa-форма CD30 вырабатывается мембраносвязанной молекулой путем протеолитического распада и может быть обнаружена в больших концентрациях в сыворотке крови пациентов.

В крупных анапластических опухолевых клетках экспрессия CD30 ограничена мембраной, цитоплазмой и точечной (гранулярной) реакцией (dot-like) в области аппарата Гольджи.

В мелкоклеточном варианте только крупные анапластические клетки (чаще сосредоточенные около сосудов) проявляют положительную экспрессию CD30, в то время как мелкие опухолевые клетки чаще являются слабопозитивными или негативными на CD30.

Воспроизводимость диагноза АККЛ по морфологическим признакам составляет 46% и может быть увеличена до 85% при иммунном окрашивании на CD30, и, тем не менее, именно иммунные реакции на CD30 должны всегда проводиться параллельно с определением наличия прочих лимфоидных и нелимфоидных маркеров, потому что экспрессия CD30 не является специфической чертой только АККЛ и наблюдается в нормальных активированных клетках других В- и Т-клеточных лимфоидных и нелимфоидных опухолей, а также при негемопоэтических злокачественных заболеваниях, некоторых карциномах и новообразованиях из герминогенных клеток.

Однако при анапластической крупноклеточной лимфоме характерным является выраженная, интенсивная реакция на CD30 в подавляющем большинстве клеток. Другие неоплазмы могут также характеризо-ваться положительной СР30-реакцией, но обычно менее интенсивной и гетерогенной.

Положительная экспрессия эпителиально-мембранного антигена (ЕМА) наблюдается более чем в 50% случаев АККЛ, хотя в некоторых случаях экспрессия положительна только в части опухолевых клеток. Опыт многих работ показал, что экспрессия EMA при АККЛ чаще наблюдается у детей и молодых пациентов и сочетается с благоприятным прогнозом.

В настоящее время ИВХ-реакцию на определение экспрессии ALK-белка принято считать наиболее специфичным диагностическим методом.

Современная усовершенствованная генная технология продемонстрировала аномальную экспрессию кластерина (clusterin) при системных АККЛ и ее отсутствие при кожных формах. Наличие кластерина не коррелирует с экспрессией АLК-белка, что характерно для экспрессии BCL-2 и с-Мус. Было установлено, что экспрессия BCL-2 возможна в основном при АLК-негативных вариантах, а ядерная экспрессия с-Мус, напротив, у АLК-позитивных анапластических крупноклеточных лимфом, что позволяет заключить, что наличие АLК-белка может оказывать влияние на индукцию апоптоза при АККЛ.

Системные АККЛ имеют два главных иммунофенотипа: Т- и О-клеточный. Большинство случаев имеют Т-клеточное происхождение, что подтверждается экспрессией одного или нескольких Т-клеточных антигенов. АККЛ О-клеточного фенотипа, возможно, принадлежит к Т-клеточному фенотипу, так как опухолевые клетки обычно экспрессируют цитотоксические молекулы: перфорин, гранзим В (granzyme) и Т1А-1.

Кожная анапластическая крупноклеточная лимфома характеризуется Т-фенотипом, но при этом отличается от системной формы, так как всегда АLK-негативна и обычно не экспрессирует ЕМА и цитотоксические молекулы.

Молекулярно-генетическая характеристика анапластической крупноклеточной лимфомы

По данным мировой литературы, в 60-70% случаев АККЛ наблюдается t(2;5)(q23q35), которая вызывает слияние гена ALK хромосомы 2 с геном NPM (нуклеофозмин) хромосомы 5. Следует отметить, что при периферических лимфопролиферациях в отличие от случаев, наблюдаемых при острых лейкозах, хромосомная транслокация, ведущая к появлению гибридных генов, редка.

Дикий тип NPM-гена отвечает за кодирование филогенетически-консервированного и повсеместно проявляемого 37 kDa кислотного фосфобелглавных аргирофильных нуклеолярных (ядрышковых) белков (AgNOR ядрышек). Основной функцией NPM является перенос только что синтезированных белков в ядрышко. Для выполнения этой функции необходимы домен олигоомеризации N-концевой области и два ядерных сигнала в С-конечной области.

Область ядрышковых организаторов (ОЯОР) представляет собой участок вторичных перетяжек акроцентрических хромосом, где локализованы гены, кодирующие рибосомную РНК (рРНК), и формируется ядрышко непосредственно после деления клетки. С ОЯОР ассоциированы кислые негистоновые аргирофильные белки, регулирующие процесс синтеза рРНК и образование рибосом. Среди аргирофильных белков ОЯОР наиболее охарактеризованы РНК-полимераза I, белки С23 (нуклеолин) и В23 (нуклеофозмин).

Аргирофильные свойства ассоциированных с областью ядрышковых организаторов кислых негистоновых белков используются при выявлении ОЯОР при помощи нитрата серебра. Образующиеся при этом гранулы серебра являются маркерами ОЯОР. Показано, что нитратом серебра выявляются транскрипционно активные ОЯОР, и в этой связи степень аргирофилии ядрышковых структур может рассматриваться как цитохимический эквивалент функциональной активности рибосомных генов. Аргирофильные белки играют важную роль в регуляции клеточного цикла, определяя его продолжительность.

При исследовании различных опухолей было выявлено повышение содержания в них белков области ядрышковых организаторов по мере прогрессирования злокачественного процесса. При этом, как было показано экспериментальными исследованиями, наблюдаемое повышение содержания белков ОЯОР происходит не в результате синтеза новых белков этого класса, а в результате усиленного синтеза белков ОЯОР — С23 и В23. Эти результаты позволили рассматривать активность области ядрышковых организаторов как один из критериев разграничения доброкачественных и злокачественных новообразований, выявления опухолей высокой и низкой степени злокачественности, определения прогноза.

ALK-ген дикого типа кодирует крупный, гликилизированный, 200 kDa трансмембранный рецептор, ближе всего связанный с Ltk (лейкоцитотирозинкиназа), для которого соответствующий лиганд до сих пор не установлен и его обычная функция не определена.

Местонахождение ALK-гена дикого типа в нормальных тканях ограничено поверхностной мембраной и цитоплазмой. Внутрицитоплазматический конец ALK несет тирозинкиназа каталитической области, которая физиологически активируется в результате гомодимеризации и связывания лигандов.

Как следствие t (2;5) часть гена NPM, кодирующая аминоконечную область NPM (аминокислоты 1-116), сливается с частью гена ALK, кодирующей всю цитоплазматическую область белка ALK (последние 563 аминокислоты ALK) (рис. 1). В результате ген ALK попадает под контроль промотера NPM, что в свою очередь ведет к перманентному и повсеместному считыванию кода гибридного NPM-ALK-гена и получению 80 kDа рекомбинантного белка, обозначаемого NPM-ALK, или р80 (рис. 1).

Рис. 1. Молекулярная структура нуклеофозмина (NPM), киназы анапластической лимфомы и гибридных форм ALK.

Рекомбинантный белок NPM-ALK способен образовывать гомодимеры (путем перекрещивания с NPM дикого типа). Образование гомодимеров ведет к конституционной активации каталитической области ALK путем имитации рецепторной димеризации и активации. In vitro трансфекция NPM-ALK в клеточные линии мышей/крыс ведет к формированию трансформированного фенотипа. Мало известно о сигнальных путях, по которым NPM-ALK оказывает онкогенное действие.

Фосфолипаза С-у, по всей видимости, является важной мишенью для NPM-ALK. На самом деле этот гибридный белок может связываться in vitro с областями SH2 фосфолипазы С-у, что ведет к ее тирозинфосфорилированию и активации с последующей трансдукцией митогенных сигналов. NPM-ALK, вероятно, связан с фосфатидилинозитом (PI-3K) и производит конститутивную активацию путей антиапоптозной PI-3-киназы/ALK.

Менее ясной представляется роль взаимодействий NPM-ALK и других сигнальных молекул, а именно STAT5 и внутриклеточной областью CD30. In vitro NPM-ALK также связывается с Shc и субстратом инсулинового рецептора (insulin receptor substate 1, IRS-1), но эти взаимодействия не являются необходимыми для трансформации. Наконец, полученные противоречивые сведения, которые свидетельствуют о прямой подаче сигнала от NPM-ALK к соединительному белку GRB2, но в то же время у NPM-ALK не было найдено области, отвечающей за распознавание GRB2.

Онкогенные свойства NPM-ALK in vivo подтверждаются экспериментальными данными, показывающими, что инфузия мышиных гемопоэтических клеток с трансфекцией NPM-ALK ведет к развитию лимфом. В то же время эти мышиные лимфомы имеют В-клеточное происхождение и, очевидно, отличаются от ALK-положительной лимфомы, развивающейся у людей, Т- и О-типа.

Эти данные наводят на мысль о том, что активация одного и того же тирозинкиназасигнального пути может, с одной стороны, носить онкогенный характер в различных типах клеток, а с другой — свидетельствовать о взаимодействии NPM-ALK с широким диапазоном опухолевых молекул.

Рис. 2. Молекулярные механизмы взаимодействия NPM-ALK.

Для обнаружения NPM-ALK транслокаций в тканевых срезах существует несколько методов: PCR, метод in situ гибридизации, флюоресцентная in situ гибридизация (FISH). Так как при использовании метода PCR возможны артефакты и его применение требует высококачественного RNA, а FISH занимает много времени, иммуногистохимическое исследование, с практической точки зрения, является наиболее удобным и широко используемым методом, так как оно имеет строго определенные показания и легкое исполнение, недорого и дает быстрый результат.

Более того, этот метод позволяет использовать архивный, залитый в парафин материал, что дает возможность судить о природе меченых клеток и архитектонике тканей, а также определять молекулярные варианты АККЛ, которые несут гибридные гены, отличные от NPM-ALK, и не распознаются с помощью PCR.

Поликлональные и с недавних пор крайне специфические моноклональные антитела, направленные против фиксатор-резистентных эпитопов цитоплазматической области ALK, т.е. антитела ALK1 и ALKc, а также антитела против N-концевой области NPM, стали доступными для оптимального иммуногистохимического (ИГХ)-распознавания этих белков в парафиновых срезах. В отличие от копий NPM-ALK и ATIC-ALK, распознающихся с помощью PCR даже в низком содержании в обычных и реактивных лимфоидных тканях, белок ALK не экспрессируется в нормальных тканях, за исключением некоторых клеток нейрогенного происхождения.

Поэтому присутствие ALK-белка при проведении ИГХ-анализа в тканях, отличных от тканей мозга, является свидетельством аномального проявления ALK, обычно в форме связанного с t(2;5) химерного белка NPM-ALK. ИГХ-свидетельство молекулярной связи распознанного ALK c NPM находится в субклеточном распределении белка ALK, который в случае t(2;5) можно увидеть не только в цитоплазме, но и в ядре.

Около 15-20% ALK-позитивной AKKA дают неожиданный для t(2;5) ИГХ-рисунок в виде ограниченной цитоплазмой экспрессии ALK и ограниченной ядром экспрессии NPM (N-конец) (рис. 3). На основании этих результатов были высказаны предположения о существовании молекулярных вариантов AKKA, при которых в качестве партнера при слиянии с ALK выступает ген, отличный от NPM, и это приводит к возникновению иных гибридных белков ALK.

Рис. 3. Экспрессия различных гибридных белков ALK.

Возможность того, что отличные от NPM гены могут вступать в контакт с геном ALK и приводить к появлению отличных от NPM-ALK рекомбинантных ALK-белков, была высказана в связи с наличием цитогенетических данных, показывающих, что при AKKA ген ALK 2p23 присутствует в генетических аномалиях, отличных от t(2;5), например t(1;2) (q21; p23), t(2;3)(p23q21) и инверсии (p23;q35).

В настоящее время нет убедительного ответа на вопрос, представляется ли ALK-негативный вариант AККЛ отдельной нозологической единицей или является подвариантом неспецифицированной периферической T-клеточной лимфомы.

Ответ на этот вопрос может быть дан в результате детального изучения молекулярных механизмов лимфомагенеза. Для клинической практики патолог должен диагностировать анапластическую крупноклеточную лимфому согласно строгим критериям, описанным выше, определяя в каждом случае основное — является ли опухоль ALK-позитивным или ALK-негативным вариантом, поскольку высказываются мнения о прогностическом значении этого феномена.

ALK-позитивная АККЛ представляет собой широкий морфологический спектр — от мелкоклеточного до крупноклеточного варианта АККЛ. Ядерная ALK-экспрессия — признак транслокации (2;5) — мелких и крупных клеток опухоли является доказательством, что они принадлежат к одному и тому же неопластическому клону. В некоторых случаях трансформация мелкоклеточного варианта в анапластической крупноклеточной лимфоме классического типа связана с приобретением дополнительной хромосомной аномалии, вовлекающей половую хромосому и хромосомы 6, 7, 9 и 15.

И.В. Поддубная, А.А. Семенова, Н.А. Пробатова

Лимфоцитарная лимфома – новообразование, происходящее из лимфоцитов, клеток, присутствующих в крови, в костном мозге и в лимфоузлах. Наиболее ярко выраженной ее разновидностью является лимфоплазмоцитарная лимфома (макроглобулинемия Вальденстрема) – вялотекущая лимфома, которая была впервые описана шведским врачом Яном Вальденстремом в 1944 году. Ежегодно от 3 до 5 человек из 1 000 000 заболевают лимфоплазмоцитарной лимфомой. Лимфоцитарная лимфома составляет около 1-2% всех случаев рака крови. Заболевание чаще встречается у мужчин, чем у женщин.

В чем суть заболевания?

Типичными признаками лимфоцитарной лимфомы являются головокружение и головные боли

Макроглобулинемия Вальденстрема – это злокачественное заболевание лимфатической системы. При лимфоплазмоцитарной лимфоме в костном мозге, лимфатических узлах или селезенке злокачественно измененные В-лимфоциты (подтип белых кровяных клеток) бесконтрольно размножаются.

В международной классификации болезней 10-го пересмотра (МКБ-10) лимфоплазмоцитарная лимфома обозначается кодом C88.0.

Причины

Точные причины развития заболевания неизвестны. Хотя опухолевые клетки имеют изменения в генах, никто не знает, что вызывает эти генетические изменения. В 20% случаев у пациентов с болезнью Вальденстрема есть родственник первой степени, у которого также была диагностирована лимфома.

Лимфоцитарная лимфома относится к группе индолентных (медленнорастущих) В-клеточных лимфом: это различие важно, потому что схема лечения медленнорастущих и быстрорастущих злокачественных новообразований отличается.

Основные факторы риска:

• возраст старше 65 лет;
• уровень гемоглобина ниже 11 г/дл;
• концентрация тромбоцитов ниже 100 г/л;
• бета-2-микроглобулин более 3 мг/л;
• концентрация антител класса М выше 70 г/л.

Симптомы

Усталость и снижение способности концентрировать внимание – наиболее распространенные признаки лимфоплазмоцитарной лимфомы (70% пациентов) и мелкоклеточной лимфоцитарной лимфомы. Они вызваны тем, что клетки лимфомы подавляют нормальное кроветворение в костном мозге, что может привести к анемии.

Из-за отсутствия тромбоцитов у пациентов могут возникать поверхностные кровотечения на коже или в других органах (10% пациентов).

Диагностика

Лучевая диагностика ( компьютерная и магнитно-резонансная томография) позволяет выявить наличие опухолевых образований в различных частях тела, которые не доступны врачу при внешнем осмотре

Вначале врач собирает анамнез и проводит физический осмотр пациента. Диагноз ставится на основе клинических, лабораторных, иммунологических и генетических данных.

Для установления диагноза лимфоцитарной лимфомы требуется взять образец ткани костного мозга и отправить на гистологическое исследование. Биопсия проводится под анестезией. Как правило, образец ткани берут на гребне подвздошной кости.

Ткань увеличенных лимфатических узлов также должна быть исследована специалистом по лимфоме. Если возможно, лимфатический узел следует полностью удалить хирургическим путем. Если пораженный лимфатический узел труднодоступен, более крупные образцы тканей можно альтернативно взять с использованием биопсии пуансона. Образцы, полученные с помощью тонкой иглы, недостаточны для точной диагностики.

В лабораторных анализах наблюдается увеличение количества моноклонального иммуноглобулина М. Гистологическое и цитологическое исследование костного мозга выявляет увеличение зрелых лимфоцитов при лимфосаркоме этого вида.

После определения вида лимфомы рекомендуется провести дополнительные обследования: компьютерную томографию, ПЭТ-КТ, МРТ, рентгенографию и ультразвуковое исследование.

Благодаря этим методам визуализации местоположение злокачественной опухоли можно определить более точно, что особенно важно для лучевой терапии.

Классификация

Для определения стадии индолентной лимфоцитарной лимфомы используют классификацию по Анн-Арбор:

• I стадия: вовлечение одного лимфоузла или органа вне лимфатической системы;
• II стадия: вовлечение одного или нескольких лимфатических узлов на одной стороне диафрагмы с или без поражения других тканей;
• III стадия: поражение двух или более лимфоузлов на обеих сторонах диафрагмы с поражением органов вне лимфатической системы;
• IV стадия: поражение нескольких лимфоузлов с одновременным поражением органов.

Также выделяют бессимптомную (А) форму болезни и форму с выраженными симптомами (В).

Лечение

Выбор программы лечения зависит от вида лимфомы и состояния больного

У пациентов с незначительными или развивающимися симптомами требуется немедленно начать терапию. Другой причиной срочного начала лечения являются изменения в картине крови – анемия.

Если лечение необходимо, существует несколько вариантов подавления болезни. Однако полностью вылечиться невозможно.

• химиотерапия;
• радиотерапия;
• трансплантация стволовых клеток;
• поддерживающая терапия – плазмаферез;
• комбинация химиотерапии и плазмафереза.

Ионизирующее излучение повреждает ДНК раковых клеток. Излучение повреждает не только ДНК опухолевых клеток, но и здоровых тканей. Здоровые клетки лучше способны восстанавливать ДНК, чем раковые: эта разница в регенерации ДНК является самой большой при относительно низкой дозе излучения. Чтобы использовать эту разницу, излучение часто делится на множество небольших количеств (фракций) и проводится в течение нескольких дней.

В начале пациентам назначают иммунохимиотерапию: это комбинация химиопрепарата (например, Бендамустина) и моноклонального антитела. Другие эффективные методы лечения включают Ритуксимаб в сочетании с ингибитором протеасомы. Этот активный ингредиент ингибирует распад белка в клетках лимфомы и, таким образом, препятствует их выживанию (происходит накопление ненужного белка).

Для молодых пациентов высокодозная химиотерапия и трансплантация костного мозга – еще один способ приостановить развитие болезни. Обычно берутся стволовые клетки от самого пациента и после химиотерапии, неповрежденные, обратно вводятся в кровоток. Стволовые клетки от здоровых доноров используются только в исключительных случаях и у молодых пациентов с клинически агрессивным течением, так как лечение имеет высокие риски и побочные эффекты.

Схема лечения зависит от возможных сопутствующих заболеваний, возраста и общего физического состояния конкретного пациента. Пациенты страдают от повышенной вязкости крови, поэтому рекомендуется выполнить плазмаферез до начала иммунохимиотерапии.

Снижение количества эритроцитов или тромбоцитов в крови – один из признаков недуга, поэтому общий анализ крови необходим для преждевременного выявления заболевания

Для достижения долгосрочных эффектов от лечения необходимо регулярно проверять состояние пациента. Такие контрольные проверки необходимо проводить каждые три месяца в первые два года после окончания терапии. С третьего года обследование проводится с ежегодными интервалами. Во время последующих обследований также рассматривается вопрос о том, возникают ли долгосрочные побочные эффекты.

Следующие исследования рекомендуется проходить всем пациентам с лимфоплазмоцитарной лимфомой:

• физический осмотр;
• общий и биохимический анализы крови;
• анализы на концентрацию лактатдегидрогеназы;
• обследование печени и почек;
• рентгенографическое и ультразвуковое обследование;
• контроль лабораторных данных (IgM) и участков заболевания, которые были заметны до лечения.

Прогноз пациентов с лимфоцитарной лимфомой

Как и в случае с другими лимфомами, описанные выше методы лечения помогают устранить симптомы, но неспособны полностью вылечить пациента. В некоторых случаях у пациентов не развиваются клинические симптомы в течение многих лет, хотя болезнь медленно прогрессирует. Цель терапии – максимально подавить заболевание и сохранить качество жизни пациентов.

Отсутствие нормальных лимфоцитов приводит к синдрому дефицита антител, что приводит к развитию иммунодефицита и частому возникновению сопутствующих инфекций.

В общей сложности 50% пациентов выживают после 10 лет с момента постановки диагноза; некоторые из них имеют высокое качество жизни даже после более чем 20 лет жизни.

При возникновении любых симптомов пациентам с лимфомой в обязательном порядке необходимо обращаться за консультацией к врачу, чтобы избежать развития опасных для жизни последствий.

*Импакт фактор за 2018 г. по данным РИНЦ

Журнал входит в Перечень рецензируемых научных изданий ВАК.

Читайте в новом номере

к.м.н. Л.Ю. Андреева, профессор М.А. Волкова, профессор М.А. Френкель

Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН

В ыделение на основании исходных прогностических факторов группы больных, имеющих низкую вероятность достижения ремиссии или высокий риск развития рецидива с целью индивидуализации лечения, является перспективным направлением в современной терапии злокачественных новообразований. Необходимость разработки индивидуальных подходов к терапии различных по прогнозу групп больных продиктована потребностями клиники. Такой подход может основываться только на углубленном изучении молекулярно–биологических особенностей опухолевой клетки. Одним из методов, раскрывающим новые перспективы в понимании антигенных, биохимических и гистогенетических характеристик клеточных структур и дающих возможность глубже понять природу опухоли, особенности ее возникновения, развития и прогрессирования, является иммунофенотипирование. С появлением высокоспецифичных реагентов – моноклональных антител (мкАТ), позволяющих определять и разграничивать специфические антигенные детерминанты, онкологи получили возможность более точного определения диагноза и прогноза заболевания, а также выбора наиболее оптимальной тактики лечения пациента. Неоспоримыми достоинствами иммунофенотипирования являются его высокая чувствительность, специфичность и относительная простота. Данный метод обеспечивает детальную характеристику фенотипа опухоли при диагностике, позволяет идентифицировать отдельные остаточные опухолевые клетки, персистирующие в организме больного во время ремиссии.

Наибольшее развитие метод иммунофенотипирования получил при опухолях крови. Основным и, пожалуй, единственным на сегодняшний день методом лечения гемобластозов является химиотерапия. На примере острых лейкозов наглядно демонстрируется возрастание роли молекулярно–биологических (иммунофенотипических) факторов прогноза по мере интенсификации программ химиотерапии. При этом стандартные прогностические факторы (клинические, гематологические, морфоцитохимические) утрачивают свое значение и отходят на второй план. Эволюция взглядов на факторы прогноза, наблюдаемая при гемобластозах человека и указывающая на возрастание роли иммунофенотипа в условиях современных схем химиотерапии, может явиться своего рода моделью и для ряда соматических опухолей, являющихся объектами химиотерапии, при которых иммунофенотипические подходы пока еще разработаны недостаточно.

Иммунофенотипирование является обязательным методом исследования при гемобластозах в целом и при острых нелимфобластных лейкозах (ОНЛЛ), в частности. Помимо диагностического аспекта, значение изучения иммунофенотипа бластных клеток при ОНЛЛ заключается в том, что наличие некоторых антигенных детерминант ассоциируется с агрессивностью течения и результатами терапии [4, 7, 8, 13, 15, 20]. На сегодняшний день решены еще не все вопросы относительно прогностической ценности экспрессии тех или иных антигенов при ОНЛЛ и последствий, которые влечет за собой их обнаружение с точки зрения лечебной тактики. Представленные в нашей работе результаты отражают общие тенденции комплексного и углубленного изучения иммунофенотипической характеристики ОНЛЛ во взаимосвязи с прогнозом заболевания, которое ведется в крупнейших клиниках мира.

Характеристика больных и методы исследования

Установление диагноза ОНЛЛ и определение морфоцитохимического варианта заболевания осуществлялось в соответствии с критериями FAB–классификации.

Определение иммунологического фенотипа бластных клеток проводилось методом непрямой иммунофлюоресценции с использованием широкой панели моноклональных антител (мкАТ). Набор мкАТ варьировал в разные годы проведения исследований и в наиболее полном виде включал миелоидные (CD11b, CD13, CD14, CD15, CD33), эритроидные (HAE–3, HAE–9), линейно не рестриктированные (CD10, CD34, CD38, HLA–DR), Т–клеточные (CD2, CD4, CD5, CD7) и В–клеточные (CD19, CD22) антигены. Мегакариоцитарные маркеры (CD41, CD61) исследовались по показаниям. Оценка результатов проводилась на проточном цитометре FАСScan (Becton Dickinson, CША) в гейте бластных клеток, идентифицируемых на основании характеристик светорассеяния. Антиген–положительными считались случаи с экспрессией маркера на более чем 20% лейкемических клеток.

Сравнение влияния иммунологических маркеров на частоту полных ремиссий (ПР) больных с наличием или отсутствием экспрессии антигенов на мембране бластных клеток производилось по таблицам сопряженности признаков. Достоверность различий оценивалась по критерию Хи–квадрат. Сравнение кривых общей и безрецидивной выживаемости (ОВ и БРВ соответственно), построенных по методу Каплан–Майера, проводилось с использованием Log–Rank теста. Различия считались достоверными при р Результаты и обсуждение

Распределение 120 больных с различными морфоцитохимическими вариантами в каждой из лечебных групп представлено в таблице 1. На основании литературных данных и опыта отделения химиотерапии гемобластозов РОНЦ морфоцитохимические варианты ОНЛЛ были разделены на прогностически благоприятные (М1, М2, М3, М4эоз) и прогностически неблагоприятные (М0, М2баз, М4, М5, М6, М7). Во всех группах, за исключением аклакур–цитарабиновой, преобладали прогностически благоприятные FAB–варианты. Статистический анализ во всех 4–х группах не выявил достоверных различий в возрасте, частоте тех или иных клинико–гематологических показателей и клинических симптомов. Результаты использования цитарабина с различными антрациклиновыми производными приведены в табл. 2.

В настоящее время адекватная цитостатическая и симптоматическая терапия позволяет преодолевать многие отрицательные клинико–гематологические факторы, которые до 1980–х годов оказывали решающее влияние на прогноз ОНЛЛ. С возрастанием интенсивности терапии роль некоторых из этих факторов (например, глубины тромбоцитопении и анемии, процентного содержания бластных клеток в крови и костном мозге) полностью нивелировалась, однако другие признаки (возраст, уровень лейкоцитов, морфоцитохимическая характеристика бластных клеток), самостоятельно или в совокупности, по–прежнему сохраняют свою прогностическую значимость [5, 16, 19]. В условиях различных химиотерапевтических режимов роль клинико–гематологических факторов прогноза нами была подтверждена. При этом особенности использованной программы терапии накладывали свой отпечаток на реализацию тех или иных прогностических факторов. Из табл. 3 видно, что при применении современных программ химиотерапии, в частности, при использовании идарубицина, прогностическая роль общепринятых клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов практически полностью нивелируется. Таким образом, в условиях интенсивных химиотерапевтических режимов достаточно сложно, опираясь только на вышеуказанные факторы прогноза, определять степень агрессивности опухолевого процесса до начала лечения. С этой целью была проанализирована роль иммунологических особенностей лейкозных клеток больных ОНЛЛ.

Уникальной особенностью бластных клеток при ОНЛЛ является сохранение ими дифференцировочного статуса клеток–предшественников гемопоэза. Однако в отличие от нормальной клеточной дифференцировки, при которой невелик процент клеток, коэкспрессирующих маркеры различных линий и стадий гемопоэза, при ОНЛЛ одновременная экспрессия в норме не встречающихся антигенов определяется в 85% случаях [21]. Таким образом, лейкозный клон клеток, имеющий однородные морфоцитохимические характеристики, является гетерогенным по антигенной структуре бластных элементов, и перспективы иммунофенотипического изучения злокачественных элементов при ОНЛЛ поистине многообразны.

На основании проведенного клинико–иммунологического анализа нам удалось доказать неоднородность терапевтического ответа у больных ОНЛЛ с различным иммунофенотипом бластных клеток. Кроме того, были выявлены иммунологические маркеры, влияющие на отдаленные результаты лечения. Частота экспрессии различных антигенов на поверхности лейкемических клеток и достоверность их влияния на частоту достижения ПР, БРВ и ОВ представлены в табл. 4.

Рис. 1. Общая выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD10 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Напротив, присутствие на бластных клетках миелоидного антигена CD13 ассоциировалось с низкой вероятностью достижения ремиссии (41,7% против 74,2% ПР в CD13–негативной группе; р = 0,07) и, как следствие, со значительно более низкой выживаемостью (медиана 5 ме. против 13 мес соответственно; р = 0,06). Подобные данные есть в литературе [16]. Кроме того, наличие маркера CD13 в иммунофенотипе коррелировало с высоким показателем лейкоцитов в дебюте заболевания. Все случаи ОНЛЛ, сопровождавшиеся экспрессией CD13, характеризовались уровнем лейкоцитов свыше 50 тыс в 1 мкл крови, в то время как при отсутствии этого маркера исходный средний уровень лейкоцитов был в среднем в 2,5 раза ниже (58,8±3,07 тыс/мкл против 23,5± 6,29 тыс/мкл соответственно; р = 0,048). По–видимому, опухолевый клон клеток, характеризующийся экспрессий CD13, обладает высоким пролиферативным потенциалом и крайней агрессивностью течения. Однако значение экспрессии антигена CD13 нельзя считать окончательно установленным. Для более весомого заключения о роли данного маркера нужны дополнительные исследования.

Рис. 2. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD7 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Установление экспрессии антигена CD34 позволяет диагностировать особую подгруппу ОНЛЛ, в которой злокачественная трансформация произошла на уровне полипотентной стволовой клетки. Как видно из рис. 3, экспрессия данного маркера на лейкемических бластах была статистически достоверно связана с более короткой продолжительностью ПР. Так, у больных с наличием маркера CD34 в иммунофенотипе медиана продолжительности ПР составила 10 мес. Ни у кого из больных длительность ремиссии не превысила 12 мес. В то же время в группе больных, на бластных клетках которых отсутствовала экспрессия стволовоклеточного антигена, медиана продолжительности ПР составила 17 мес; 2 года и более без рецидива прожили более 40% больных (р = 0,01). Кроме того, обнаружение CD34 антигена на мембране бластных клеток связано с более низкой частотой ремиссии (42,9%) по сравнению с CD34–негативными случаями (67,2%). Видимо, малочисленность CD34+ группы является причиной того, что выраженные различия в частоте получения ремиссий не являются статистически значимыми. Необходимо отметить, что в группе больных, лейкемические клетки которых экспрессировали стволовоклеточный антиген, отмечался более молодой возраст (30,3±7,2 лет против 40,1±2,3 лет соответственно; р = 0,3) и отсутствие экстрамедуллярных проявлений заболевания, в то время как у 8 (25,8%) из 31 CD34–негативных пациентов такие проявления были; различий по другим клиническим и гематологическим показателям отмечено не было (р > 0,95).

Рис. 3. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD34 на поверхности бластных клеток без учета программы терапии.

Вопрос о прогностической роли эритроидных антигенов крайне затруднительный. Это объясняется тем, что в зарубежных клиниках гликофорин А (отечественные мкАТ – НАЕ–3) исследуется только по показаниям (для дифференциальной диагностики М6 ОНЛЛ), а экспрессия антигена эритробластов (мкАТ – НАЕ–9) не изучается (эти мкАТ получены в лаборатории акад. Г.И.Абелева РОНЦ им. Н.Н. Блохина РАМН и используются только в нашей стране). Поэтому вопрос о прогностической значимости эритроидных антигенов во многом остается открытым. В нашем наблюдении экспрессия бластными клетками гликофорина А была ассоциирована с более короткой продолжительностью ПР (медиана 1,5 мес против 16 мес; р = 0,02). Данный антиген был изучен у 44 больных и в 3–х случаях он был позитивным, что составляет 7% и соответствует частоте встречаемости острого эритробластного лейкоза, для которого он является патогномоничным. В наших более ранних исследованиях негативное влияние на БРВ обоих эритроидных маркеров оказалось взаимодополняющим [1]. Несомненно, для окончательного заключения требуется дополнительный набор материала. Однако полученная даже на небольшой выборке достоверная корреляция свидетельствует о недостаточности стандартной цитозар–антрациклиновой терапии для лечения больных с М6 вариантом ОНЛЛ.

Как видно из изложенных выше данных, нами установлен ряд факторов, ассоциированных с продолжительностью болезни и ремиссии у больных ОНЛЛ, проанализированных без учета используемого антрациклинового производного. Располагая достаточно большим клиническим материалом, накопленным за 15 лет наблюдения, в течение которых в отделении химиотерапии гемобластозов РОНЦ РАМН использовались 4 программы химиотерапии, и, принимая во внимание то, что отдельные иммунофенотипы ОНЛЛ могут иметь особенности в чувствительности к различным антрациклинам, мы попытались провести сравнительное изучение влияния иммунологического фенотипа на результаты лечения в пределах отдельных программ.

Как нами было показано (табл. 3), ни один из клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов не оказывал влияния на прогноз ОНЛЛ в условиях применения программы лечения с включением идарубицина. По этой причине мы остановились именно на данной программе с целью демонстрации возрастающей роли иммунологических факторов прогноза у этих конкретных больных.

При использовании идарубицин–цитарабиновой комбинации, как и при других химиотерапевтических программах, сохранялось негативное прогностическое влияние на ОВ и БРВ экспрессии антигена CD7 (р = 0,03). Кривые выживаемости представлены на рис. 4. Кроме того, обнаружение на опухолевых клетках антигена CD34 ухудшало БРВ, при этом разница приближалась к достоверной (p = 0,06). Но вместе с тем выявились маркеры, присутствие которых при применении идарубицина, в отличие от других антрациклиновых производных, значительно улучшало прогноз.

Рис. 4. Общая (А) и безрецидивная (Б) выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD7 на поверхности бластных клеток при идарубицин-цитарабиновой программе терапии.

При использовании идарубицина отмечался интересный факт: наиболее чувствительными к индукционной терапии были больные с CD38–позитивными бластными клетками. При экспрессии на бластных клетках маркера CD38 частота ПР была более чем вдвое выше, чем при CD38– ОНЛЛ: 68,2% и 33,3% соответственно (р = 0,07). Больные с наличием в иммунофенотипе бластов молекулы CD38 также имели более длительную ПР (рис. 5). Так, 44 и более месяцев без рецидива прожил каждый четвертый больной, на опухолевых клетках которых отмечалась экспрессия CD38 антигена. В то же время длительность безрецидивного периода ни у одного из CD38–негативных больных не превысила 13 меc (р = 0,013).

Рис. 5. Безрецидивная выживаемость больных ОНЛЛ в зависимости от экспрессии антигена CD38 на поверхности бластных клеток при идарубицин-цитарабиновой программе терапии.

Также была отмечена благоприятное прогностическое влияние на ОВ коэкспрессии миелоидных антигенов CD15 и CD33 (медиана 10 мес против 4 мес; р = 0,05) и В–клеточных маркеров CD19 и CD22 (медиана 43 мес против 5 мес; p = 0,032).

Приведенные данные убедительно показывают, что снижение прогностической роли общепринятых клинико–гематологических и морфоцитохимических факторов в условиях современной химиотерапии ОНЛЛ отнюдь не отражает улучшение прогноза у всех больных. Выделить резистентную или, напротив, более благоприятную в прогностическом плане группу позволяют молекулярно–биологические особенности бластных клеток, установленные методом иммунофенотипирования.

Таким образом, приведенные в нашей статье данные свидетельствуют о том, что иммунологическое исследование является необходимым компонентом первичного обследования больных ОНЛЛ. Помимо изучения чисто клинических аспектов, иммунофенотипирование позволяет глубже понять природу этого заболевания и особенности его течения. Выделение на основании исходных прогностических факторов (включая иммунофенотип) групп больных, имеющих низкую вероятность достижения ремиссии или высокий риск развития рецидива, позволяет индивидуализировать лечение и улучшать его результаты [2]. Это перспективное направление в современной терапии злокачественных новообразований в целом и ОНЛЛ, в частности.

1. Калетин Г.И., Тупицын Н.Н., Волкова М.А. и др. // Новое в онкологии / Под ред. И.В. Поддубной и Н.А.Огнерубова. – Воронеж, 1997. – С. 11–14.

2. Маркина И.Г., Волкова М.А., Тупицын Н.Н. и др. // Новое в онкологии / Под ред. И.В. Поддубной и Н.А.Огнерубова. – Воронеж, 1999. – С. 5–11.

3. Adamczyk–Cioch M.B., Dmoszyncka A., Hus M. et al. // Pol. Arch. Med. Wewn. – 1995. – Vol. 94(1). – P. 40–46.

4. Baer M.R., Stewart C.C., Lawrence D. et al. // Blood. – 1997. – Vol. 90 (4). – P. 1643–1648.

5. Bennett J.M., Catovsky D., Daniel M.T. // Ann. Int. Med. – 1985. – Vol. 103 – P. 626–629.

6. Boekhonrst R.A.W., Leeun R., Schoester M. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 82(10). – P. 3157–3162.

7. Bradstock K., Matthews J., Benson E. et al. // Blood. – 1994. – Vol. 84 (4). – P. 1220–1225.

8. Casasnovas R.O., Solary E., Campos L. et al. // Leuk. Lymphoma. –1994. – Vol. 13(1). – P. 109.

9. Cuneo A., Fagioli F., Passi I. et al. // Leuk. Res. – 1992. –Vol. 16 (8). – P. 789–796.

10. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. // Leuk. Lymphoma. – 1995. – Vol. 17(2). – P. 111–119.

11. Del Poeta G., Stasi R., Venditti A. et al. // Leukemia. – 1994. – Vol. 8(3). – P. 388–394.

12. Greaves M.F. // Cancer Surveys. – 1982. – Vol.1(2). – P.189–204.

13. Guinot M., Sans G.F., Sempere A. et al. // Br. J. Haematol. – 1991. – Vol. 78. – P. 533–534.

14. Haynes B.F., Martin M.E., Kay H.H. et al. // J. Exp. Med. – 1988. – Vol. 168. – P. 1061–1080.

15. Kita K., Miwa H., Nakase K. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 81(9). – P. 2399–2405.

16. Kristensen J.S., Hokland R. // Leuk. Res. – 1991. – Vol. 15 (8). – P. 693–700.

17. Kurtzberg J., Denning S.M., Nycum L.M et al. // Proc. Natl. Acad .Sci. USA. – 1989. – Vol. 86. – P. 7575–7579.

18. Lanza F., Rigolin G.M., Moretti S. et al. // Leuk. Lymphoma. – 1994. – Vol. 13. – P. 81–85.

19. Lowenberg B., Downing J.R., Burnett A. // New England J. Med. – 1999. – Vol. 341(14). – P. 1051–1062.

20. Paietta E., Andersen J., Yunis J. et al. // Br. J. Haematol.. – 1998. – Vol. 100(2). – P. 265–272.

21. Reading C.L., Estey E.H., Huh Y.O. et al. // Blood. – 1993. – Vol. 81. – P. 3083–3090.

22. Robertson M.J., Ritz J. // Blood. – 1990. – Vol. 76. – P. 2421–2438.

23. Venditti A., Del Poeta G., Buccisano F. et al. // Leukemia. – 1998. – Vol. 12. – P. 1056–1063.