Фактор некроза опухолей полиморфизм гена

Ревматоидный артрит - хроническое системное заболевание соединительной ткани, клинически проявляющееся прогрессирующим поражением преимущественно периферических суставов по типу эрозивно-деструкивного полиартрита [1].

Ревматоидный артрит - мультифакторное заболевание, патологический процесс которого характеризуется дисбалансом противовоспалительных цитокинов со сдвигом в сторону провоспалительных цитокинов, среди которых большое значение отводится фактору некроза опухолей α (TNFα) [4]. Участие TNFα в развитии предрасположенности и клинических вариантах РА ведется в направлениях оценки содержания TNFα в сыворотке и синовиальной жидкости больных РА, уровня экспрессии м-РНК для TNFα и изучения полиморфизма гена TNFα [3].

Ген TNFα - один из самых полиморфных генов цитокинов, располагается в теломерной части шестой хромосомы в составе генов главного комплекса гистосовместимости (HLA III класса) и характеризуется высоким количеством SNPs в промоторной области, наиболее известными являются положения - 308, -238. Однако, есть и другие полиморфизмы типа SNP, например, -863, способные также влиять на экспрессию TNFα. Данные о влиянии SNPs -308,-238, -863 на экспрессию и на предрасположенность и клинические варианты РА спорны: существуют исследования, в которых показана связь этих полиморфизмов и предрасположенности и тяжести течения РА, и есть работы опровергающие роль SNPs -308, -238, -863 при РА [2, 3, 4].

Цель исследования: оценка распределения частот аллельных вариантов, генотипов и сочетаний генотипов полиморфизма типа SNP в точках -863, -308, -238 промотора гена TNFα у здоровых лиц и больных ревматоидным артритом русской этнической группы Челябинской области.

Установить распределение аллелей и генотипов в выборках здоровых лиц и больных РА в зависимости от клинического варианта РА (серопозитивный, серонегативный) РА с системными проявлениями и без них, и возраста начала РА русской этнической группы.
Оценить частоты сочетаний генотипов исследуемых полиморфизмов гена TNFα в выборках больных РА и здоровых лиц.
Оценить шансы возникновения заболевания в зависимости от носительства определенного аллеля, генотипа или комбинации генотипов.

Материалы и методы

Отбор пациентов (92 человек) проводился на кафедре госпитальной терапии Челябинской Государственной Медицинской Академии и в ревматологическом отделении Городской клинической больницы №6 (ГКБ№6) вне зависимости от стадии, клинического варианта течения заболевания и возраста начала РА. Выборка больных РА характеризовалась следующими показателями: 14 человек с системными проявлениями, полиартрит у 78 человек, серопозитивный вариант - 78, серонегативный - 16, средний возраст начала - 40,5 лет±1,5.

Контрольная группа (212 человек) составлялась из кадровых доноров костного мозга ОГУП Челябинской областной станции переливания крови. Принадлежность к этнической группе определялась по данным генеалогического анамнеза в третьем поколении (согласно рекомендациям 8-го Международного Симпозиума в 1980г., Лос-Анджелес, США). Типирование SNPs в гене TNFα - ПДРФ - анализ полиморфизма длины рестрикционных фрагментов: амплификация с последующей обработкой ампликонов эндонуклеазами рестрикции NcoI для положения -308 (G/A), BamHI для положения -238 (G/A) при 37°С, TaiI для положения -863 при 65°С. Детекция результатов - электрофорез в 8% ПААГе. Статистическая обработка результатов: иерархический логлинейный анализ для расчета критерия максимального правдоподобия (G или χ 2 _ML) и отклонений Фримана-Тьюки, позволяющие определить за счет каких ячеек таблиц сопряженности может получаться значимый эффект или тенденция к различиям. Критерий хи-квадрат с поправкой Йетса на непрерывность применялся для одной степени свободы, когда абсолютные частоты меньше 10. Для оценки вероятности возникновения признака (заболевания или какой-то клинической характеристики) в зависимости от генетического варианта (аллеля, генотипа, комбинации генотипов) применялся критерий отношения шансов (ОШ) с расчетом 95% ДИ - отношение шансов в одной группе к шансам этого же событии в другой группе. Во всех случаях различия считали статистически значимыми при р≤0,05, незначимыми при р>0,10; для промежуточных значений р (0,05≤р≤ 0,10) обсуждали тенденцию к различиям.

Результаты исследования

Распределение частот генотипов SNPs -308, -238, -863 TNFα в исследуемых выборках подчинялось закону Харди-Вайнберга.

1. Анализ распределения аллелей и генотипов SNPs -308, -238, -863 TNFα в группе здоровых лиц русской этнической группы Челябинской области. В целом распределение аллелей и генотипов исследуемых полиморфизмов соответствует частотам распределения в европеоидных популяциях, хотя имеются этнические особенности в распределении аллелей и генотипов -308 SNP. По частотам аллелей и генотипов SNPs -238, -863 представители русской этнической группы не отличаются от других популяций европеоидного происхождения [2, 5].

2. На втором этапе мы изучали распределение частот аллелей и генотипов в выборке больных РА в сравнении со здоровыми лицами и внутри группы больных. По частотам аллелей -238, -308 выборки больных РА и здоровых лиц не отличаются между собой. В группе больных РА наблюдалось повышение частоты аллеля с заменой -863 на уровне тенденции:19,57% против 14,39% в группе сравнения, χ 2 _ML=2,56, р=0,109, одна степень свободы, FT для аллеля с заменой составляет 1,216, что соответствует р 2 _ML=2,879, р=0,089, одна степень свободы, FT для аллеля с заменой составляет 1,14, р 2 ,

Фактор некроза опухолей TNF: TNF-308 (G-308A)

Информация об исследовании

Название гена: TNF (фактор некроза опухолей) / tumor necrosis factor

Исследуемый полиморфизм: TNF-308 (G-308А)

Международный код полиморфизма: rs1800629

Синонимы названия гена: кахектин, DIF, TNFSF2, ФНО

Функция гена:

Ген кодирует мультифункциональный цитокин, который относится к подсемейству факторов некроза опухолей (TNF). Этот цитокин секретируется, в основном, макрофагами и может связываться с TNFRSF1A/TNFR1 и TNFRSF1B/TNFBR, взаимодействуя с их рецепторами. Этот цитокин принимает участие в широком спектре биологических процессов, таких как пролиферация клеток, дифференциация, апоптоз, метаболизм липидов и коагуляция. Цитокин связан с рядом заболеваний включая аутоиммунные заболевания, резистентности к инсулину, и рак. Цитокин, связываясь с TNFRSF1A/TNFR1 и TNFRSF1B/TNFBR может вызвать гибель клеток некоторых опухолевых клеточных линий. Вызывает лихорадку прямого действия или путем стимуляции интерлейкина-1 секреции и участвует в индукции кахексии, при определенных условиях он может стимулировать пролиферацию клеток и индуцируют дифференцировку клеток.

Предполагают, что этот фактор играет важную роль в супрессии эритроидной дифференцировки и связанной с этим анемии, возникающей при хронических заболеваниях (хронические инфекции, различные опухоли и др.). TNF- альфа супрессирует эритропоэз на последних стадиях. При этом одновременное введение эритропоэтина и TNF-альфа предотвращает ингибирующее действие TNF-альфа.

Характерные проявления мутации:

Мутации в гене TNF передаются по наследству, как и предрасположенность к солидным опухолям, и являются своеобразными маркерами возможности их образования. Полиморфизм гена TNFA ассоциирован с уровнем экспрессии стероидных рецепторов на малигнизированных клетках молочной железы. Присутствие эстрогенового и прогестеронового рецепторов коррелирует с благоприятным прогнозом у больных раком молочной железы. Секреция TNFA опосредуется аллельным состоянием гена. Существует корреляция между полиморфизмом гена TNFA и экспрессией стероидных рецепторов у больных раком молочной железы. Этот факт определяет важное взаимодействие эндокринной и иммунной системы. Действительно, генетическая возможность продуцировать более высокий уровень TNFA иммунными клетками и адипоцитами может регулировать уровень экспрессии прогестеронового рецептора опухолевыми клетками и, таким образом, влиять на опухолевую прогрессию.

TNFA аллель также связана с повышенным уровнем продукта гена в циркулирующей крови, что является противоопухолевым фактором. Этот цитокин определяет ответ иммунной системы на воспаление, также как и IL-4 он обладает противовоспалительной активностью.

Полиморфизм в позиции -308 в промоторной области TNFA модифицирует генную экспрессию. Он является фактором риска развития бронхиальной астмы, рака молочной железы, эндометриоза, сахарного диабета 2 типа, болезни Крона, неспецифического язвенного колита, рака щитовидной железы, невынашивания беременности, аллергии.

Тип наследования мутации:

аутосомно-доминантный (встречается у мужчин и женщин с одинаковой частотой, для развития заболевания достаточно унаследовать 1 мутантный вариант гена от одного из родителей, вероятность возникновения болезни у детей составляет 50 %).

Показания к назначению исследования:

атопии в анамнезе у пациента или у близких родственников
подготовка к терапии ревматоидного артрита
бронхиальная астма
аллергии
рак молочной железы
эндометриоз
ожирение
сахарный диабет 2 типа
невынашивание беременности,
подготовка к ЭКО.

Специальной подготовки к исследованию не требуется. Необходимо следовать общим правилам подготовки к исследованиям.

ОБЩИЕ ПРАВИЛА ПОДГОТОВКИ К ИССЛЕДОВАНИЯМ:

1. Кровь рекомендуется сдавать утром, в период с 8 до 11 часов, натощак (между последним приемом пищи и взятием крови должно пройти не менее 8-ми часов, воду можно пить в обычном режиме), накануне исследования легкий ужин с ограничением приема жирной пищи.

2. Накануне исследования (в течение 24 часов) исключить алкоголь, интенсивные физические нагрузки, прием лекарственных препаратов (по согласованию с врачом).

3. За 1-2 часа до сдачи крови воздержаться от курения, не употреблять сок, чай, кофе, можно пить негазированную воду. Исключить физическое напряжение (бег, быстрый подъем по лестнице), эмоциональное возбуждение. За 15 минут до сдачи крови рекомендуется отдохнуть, успокоиться.

4. Не следует сдавать кровь для лабораторного исследования сразу после физиотерапевтических процедур, инструментального обследования, рентгенологического и ультразвукового исследований, массажа и других медицинских процедур.

Если Вы принимаете лекарства, обязательно предупредите об этом лечащего врача.

Предметы

Аннотация

Врожденные различия в выработке фактора некроза опухоли (TNF) были связаны с предрасположенностью и исходом воспалительных заболеваний. В нескольких исследованиях были предприняты попытки установить, связаны ли полиморфизмы в гене TNF или рядом с ним или другие маркеры на коротком плече хромосомы 6 (6p21) с различиями в продукции TNF. Данные об этих ассоциациях противоречивы. Поэтому мы провели исследование среди 129 здоровых людей, у которых продуцирование TNF определялось при стимуляции эндотоксином в культурах цельной крови. Микросателлит TNFa, однонуклеотидные полиморфизмы TNF в типизации +489, -238, -308 и -376. Данные показали, что аллели микросателлита TNFa и перенос полиморфизмов TNF не были связаны с продукцией TNF. Мы пришли к выводу, что гены, определяющие различия в эндотоксин-индуцированной продукции TNF, еще не идентифицированы.

Вступление

Фактор некроза опухоли (TNF), провоспалительный цитокин, играет ключевую роль в регуляции иммунных реакций. 1 При стимуляции клетки иммунной системы высвобождают TNF, тогда как в состоянии покоя TNF практически не может быть оценен. 2, 3 Во многих исследованиях изучалась связь между ФНО и заболеваниями, основанными на воспалительной этиологии. 4, 5

Ген, кодирующий TNF, расположен в области III класса человеческого антигена лейкоцитов (HLA), области, которая расположена между областью класса I HLA I и класса II, и имеет размер приблизительно 750 килобаз (кб). Около 40% генов, которые кодируются в HLA-области, участвуют в иммунных процессах. 6 Из-за расположения гена TNF в пределах HLA-региона были исследованы отношения между HLA-гаплотипами и продукцией TNF. До сих пор сообщалось о противоречивых результатах. 7 Десять однонуклеотидных полиморфизмов (SNP) были обнаружены в промоторной области TNF, один цитозин (C) -инсерционный полиморфизм в первом экзоне гена TNF и два SNP в первом интроне гена TNF. 8, 9, 10, 11 Таким образом, различные исследования пытались определить, связаны ли эти полиморфизмы с уровнями продукции TNF, предрасположенностью к заболеванию и / или тяжестью заболевания. 12, 13, 14, 15, 16, 17 Данные по этому вопросу, однако, не являются окончательными.

В предыдущем исследовании мы определили, что врожденная высокая продукция TNF в сочетании с низкой продукцией интерлейкина-10 (IL-10) является фактором риска возникновения рецидивирующего рассеянного склероза (РС). 18 Было представлено, что отсутствие аллеля 107 микросателлита TNFa связано с повышенной восприимчивостью к (рецидиву) РС. 19, 20 Другие сообщили, что аллель TNFa * 107 связан со снижением производства TNF. 7 До настоящего времени, ассоциативные исследования полиморфизмов TNF и РС сообщали о неубедительных результатах. 19, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27

В этом исследовании мы проверили, были ли связаны индуцированная эндотоксином продукция TNF и аллели микросателлита TNFa, полиморфизмов монофонического моноклонального антитела TNF в положениях +489, -238, -308 и -376 (относительно сайта инициации транскрипции). Мы также оценили связь между гаплотипами HLA-DR и продукцией TNF.

Результаты

Тринадцать аллелей с размерами от 97 до 121 пары оснований (п.н.) были обнаружены в высокополиморфном локусе TNFa (таблица 1). При использовании теста Крускалла-Уоллиса не было выявлено никакой связи между различными аллелями микросателлита TNFa и продукцией TNF, индуцированной эндотоксином ( P = 0, 22; см. Рисунок 1). Кроме того, не было существенной разницы между носителями TNFa * 107 и не носителями, то есть средняя продукция TNF среди носителей TNFa * 107 ( n = 22) составляла 17880 пг / мл, тогда как TNFa * 107 без носителей ( n = 107) имела средняя продукция TNF 15259 пг / мл ( P = 0, 15). Поскольку отсутствие переноса аллеля TNFa * 107 и перенос HLA-DR2 были связаны с восприимчивостью к рецидивирующему MS, мы проверили, были ли лица, не являющиеся носителями TNFa * 107 и носителями HLA-DR2 ( n = 36 ) отличались в производстве TNF по сравнению с другими людьми ( n = 93). Медианная эндотоксин-индуцированная продукция TNF (15654 пг / мл против 15878 пг / мл) достоверно не различалась между этими двумя группами ( P = 0, 63).

Таблица в натуральную величину

Средняя продукция TNF в образцах цельной крови, стимулированной 1000 нг / мл эндотоксина по отношению к аллелям микросаттелита TNFa, оценена у здоровых людей. Большой столбец означает среднее общее производство ФНО.

Изображение в полном размере

При использовании теста Манна-Уитни не было обнаружено связи между переносом полиморфизма одиночного нуклеотида G → A в TNF в положениях +489, -238, -308 и -376 и продукцией TNF (все P > 0, 1, см. Таблицу 2).

Таблица в натуральную величину

Носительство HLA-DR2 не было связано с продукцией TNF (продукция TNF среди HLA-DR2-носителей ( n = 42) 16535 пг / мл против 15553 пг / мл среди DR2-не-носителей ( n = 87); P = 0.99; см. рисунок 2). Аналогичные результаты были получены среди 39 человек с системной красной волчанкой, не было никакой связи между гаплотипами HLA-DR и продукцией TNF (тест Крускалла-Уоллиса: P = 0, 76). В этой группе носители HLA-DR2 оценили среднюю продукцию 16606 пг / мл по сравнению с 15962 пг / мл среди HLA-DR2-не-носителей ( P = 0, 78), а HLA-DR3-носители выявили среднюю продукцию 16875 пг / мл. мл по сравнению с 15697 пг / мл среди не носителей HLA-DR3 ( P = 0, 91).

Средняя продукция TNF в образцах цельной крови, стимулированной 1000 нг / мл эндотоксина среди HLA-DR2-носителей и HLA-DR2-не-носителей, оценена у здоровых людей.

Изображение в полном размере

обсуждение

Целью настоящего исследования было оценить, связаны ли эндотоксин-индуцированная продукция TNF в образцах цельной крови и аллелях микросателлита TNFa, однонуклеотидных полиморфизмов TNF в положениях -376, -308, -238 и +489 или HLA-DR гаплотипов., В настоящем исследовании мы не могли показать связь.

Уровни продукции TNF при стимуляции эндотоксином могут отличаться в 10 раз между индивидуумами. 28, 29, 30 Предыдущее исследование показало, что эти различия в основном определяются наследственными факторами. Сравнение корреляции продукции TNF среди монозиготных близнецов и других братьев и сестер показало, что наследуемость эндотоксин-индуцированной продукции TNF в образцах цельной крови составила 0, 60. 29 Результаты многочисленных исследований того, лежат ли в основе этих вариаций полиморфизмы в генах TNF или около них, противоречивы. 15, 31 Представленные данные свидетельствуют о том, что исследованные гены или полиморфизмы не определяют уровни индуцированной эндотоксином продукции ФНО в образцах цельной крови.

Обучение в слишком малых размерах выборки может объяснить отсутствие ассоциации. Представленное исследование было выполнено у 129 здоровых людей, исследование, которое показало связь между продукцией TNF и аллелями микросателлита TNFa, было выполнено у 75 человек. 7 Большинство исследований, в которых сообщается о связи между носителем -308A и продукцией TNF, индуцированной эндотоксином, имели меньшее количество носителей -308AG ( n 15 Сообщалось, что помимо числа исследованных людей концентрация используемого эндотоксина (ЛПС) может определять значимые или несущественные результаты. Мы использовали концентрацию эндотоксина (1000 нг / мл). Кроме того, стимуляция образцов цельной крови, только моноцитов или мононуклеарных клеток периферической крови (РВМС) может определять результат. Таким образом, мы приходим к выводу, что изученные полиморфизмы не связаны с различиями в выработке ФНО, стимулированной 1000 нг / мл эндотоксина в образцах цельной крови.

Поскольку ранее мы показали, что как высокая врожденная продукция TNF, так и низкая частота аллеля 107 микросателлита TNFa связаны с повышенной восприимчивостью к рецидивирующему MS, 18, 20 может быть интересно проверить, связаны ли эти два маркера риска, Особенно, поскольку сообщалось, что перенос TNFa * 107 и снижение производства TNF связаны. 7 Представлено другими, что более низкая частота аллеля 107 микросателлита TNFa присутствует среди пациентов с MS, которые не являются носителями HLA-DR2. 19 В наших руках оценка обеих детерминант у здоровых субъектов показала, что они не связаны между собой.

Поскольку ген, кодирующий TNF, расположен в области HLA класса III, а TNF и HLA вовлечены в воспалительные процессы, исследования были сосредоточены на продукции TNF и HLA-гаплотипах. Хотя были получены противоречивые результаты, некоторые исследования выявили связь между гаплотипами HLA-DR и высвобождением TNF. 7, 32 . Исследование показало, что линии Т-клеток, специфичные для основного белка миелина или столбнячного анатоксина от носителей HLA-DR2, секретируют больше ФНО, чем не носители HLA-DR2. 33 Однако другие сообщили о более низком спонтанном высвобождении TNF PBMC из носителей HLA-DR2 по сравнению с не носителями HLA-DR2. В том же исследовании гаплотип HLA-DR3 был связан с увеличением производства ФНО. 34 Сообщалось, что при использовании нескольких стимулов лимфоциты периферической крови (PBL) носителей HLA-DR3 продуцировали больше TNF, чем не носители HLA-DR3. 28 В настоящем исследовании и в предыдущих отчетах нашей группы 18, 32 мы не могли наблюдать связь между индуцированной эндотоксином продукцией TNF в культурах цельной крови и гаплотипами HLA-DR, включая HLA-DR2 и HLA-DR3.

Таким образом, мы заключаем, что микросателлит TNFa, полиморфизмы однонуклеотидов TNF в положении +489, -238, -308 и -376 (относительно сайта начала транскрипции) и гаплотипы HLA-DR не определяют индуцированную эндотоксином продукцию TNF в образцах цельной крови.

методы

Дизайн исследования

Метод сбора образцов крови и данных был подробно описан в другом месте. 18, 35 Чтобы оценить связь между продукцией TNF при стимуляции эндотоксином и генетическими маркерами, мы включили контрольных субъектов, которые были включены в предыдущее исследование. Лица были включены после одобрения Советом по медицинской этике Медицинского центра Лейденского университета, Лейден, Нидерланды. Изученными предметами были 129 здоровых людей (57 мужчин и 72 женщины; средний возраст 47 ± 14 лет), и они принадлежали к 54 семьям. 17 Лица с текущими инфекционными заболеваниями были исключены, поскольку инфекции могут определять уровни продукции цитокинов. Все люди были кавказскими и голландского происхождения. 35 Микросателлиты TNFa, однонуклеотидные полиморфизмы TNF и типирование HLA-DR2 были оценены в этой серии.

Во втором анализе, чтобы поддержать гипотезу о том, что унаследованные различия в эндотоксин-индуцированной продукции TNF не регулируются генетическими маркерами в или около гена TNF, мы также покажем данные об ассоциации между эндотоксин-индуцированной продукцией TNF и другими подтипами HLA-DR., Эти оценки были сделаны у 39 человек (три мужчины и 36 женщин; средний возраст 41 ± 15 лет) с системной красной волчанкой, которые были включены в предыдущее исследование. Эти люди имели сходные оценки производства ФНО по сравнению с контрольными субъектами. 35

Стимуляция цельной крови

Способы получения и стимуляции образцов цельной крови были описаны ранее. Вкратце, образцы крови были взяты между 8 и 11 часами утра, чтобы минимизировать влияние циркадных ритмов. Кровь собирали в апирогенные гепаринизированные пробирки (Endotube ® , Chromogenix, Mölndal, Sweden) и стимулировали 1000 нг / мл эндотоксина в течение 4 часов. Кроме того, были получены нестимулированные исходные образцы для контроля загрязнения. Продукцию TNF измеряли с использованием ELISA. Предел обнаружения составлял 4 пг / мл. Из-за технических ошибок не было получено ни одного TNF у семи субъектов, и поэтому они были исключены из дальнейшего анализа. ELISA были сделаны слепым к источнику материала в случайном порядке. В предыдущем исследовании мы показали, что пол или возраст не лежат в основе различий в продукции цитокинов. 30

Селекция и амплификация микросателлита TNFa

Микросателлит TNFa, высокополиморфный маркер, расположен теломерно из гена TNF в непосредственной близости от лимфотоксина α (LTα). Подробная информация об этом микроспутнике была опубликована в другом месте. 36, 37

Клетки периферической крови лизировали додецилсульфатом натрия и обрабатывали протеиназой-К. ДНК выделяли фенол-хлороформным экстрагированием. 38 Амплификацию проводили методом полимеразной цепной реакции с флуоресцентным праймером (ПЦР) в общем реакционном объеме 25 мкл, содержащем приблизительно 50 нг геномной ДНК, 12, 5 пмоль прямого и обратного праймеров, 200 мкМ дНТФ (Pharmacia Biotech, Упсала, Швеция). ), 5% (по объему) глицерина и 2, 5 единицы Taq-полимеразы (Amplitaq ® , Perkin Elmer, Foster City, CA, USA). Буфер для амплификации содержал 50 мМ KCl, 1, 5 мМ MgChl ₂, 10 мМ Трис-HCl при рН 8, 4 (комнатная температура) и 0, 06 мг / мл бычьего сывороточного альбумина. ПЦР проводили при температуре отжига от 58 до 68 ° C с использованием термоциклера Пельтье (PTC-200, MJ-Research, MA, США). Touchdown PCR была использована для повышения специфичности отжига в течение первых циклов. Для анализа количества пар оснований каждого аллеля продукты ПЦР загружали в денатурирующий секвенирующий гель (Reprogel ™ High Resolution, Pharmacia Biotech) в автоматическом лазерном флуоресцентном ДНК-секвенаторе (ALF-express II ™ , Pharmacia Biotech). Электрофорез (1500 В, 60 мА, 30 Вт при 55 ° С) и сбор данных проводили с использованием программного обеспечения ALF Manager (Pharmacia Biotech). Данные анализировали с использованием программного обеспечения ALFwin Fragment Analyzer 1.01 (Pharmacia Biotech). Точное назначение аллелей проводили с использованием маркеров внутреннего размера, меченных Cy5, и запуска внешних аллельных лестниц, состоящих из продуктов ПЦР трансформированных вирусом Эпштейна-Барр лимфобластоидных клеточных линий для каждого микросателлита. 39 Анализ образцов проводили с использованием 96-полосного секвенатора ABI 377-ДНК (Applied Biosystems, CA, USA). Данные были проанализированы с использованием программ Genescan 3.1 и Genotyper 2.0 (Applied Biosystems). Точного определения размера аллелей достигали с использованием маркеров внутреннего размера Genescan-ROX 400HD, а внешние аллельные маркеры использовали, как описано выше.

Однонуклеотидные полиморфизмы TNF и типирование HLA-DR

Типирование для однонуклеотидных полиморфизмов TNF -376, -308, -238 и +489 было выполнено с помощью ПЦР на термоцикле Perkin Elmer GeneAmp 9600 (PE-Cetus, Norwalk, CA, USA). Для выявления однонуклеотидных полиморфизмов TNF за ПЦР следовало расщепление рестриктазой. Для -376 (G → A) фрагмент размером 186 п.н. амплифицировали с прямым праймером (5'-CTAGTTCTATCTTTTTCCTGCGTCCTGTCTGGAT-3 ') и обратным праймером (5'-ATCCTCCCTGCTCCGATTCC-3'). Условия ПЦР были следующими: 10 мин при 95 ° С, затем 30 циклов: 30 с при 95 ° С, 30 с при 60 ° С и 30 с при 72 ° С. Окончательное удлинение проводили при 72 ° С в течение 10 мин. Продукты ПЦР расщепляли инкубацией с Fok I (New England Biolabs, MA, USA) при 37 ° C в течение 3 часов. Для -308 (G → A) фрагмент длиной 147 п.н. амплифицировали с прямым праймером (5′-GAGGCAATAGGTTTTGAGGGCCAT-3 ′) и обратным праймером (5′-GGGACACACAAGCATCAAG-3 ′). Условия ПЦР были такими же, как описано выше, только число циклов было увеличено до 35. Продукты ПЦР расщепляли инкубацией с Nco I (New England Biolabs) при 37 ° С в течение 2 часов. Для -238 (G → A) фрагмент длиной 165 п.н. амплифицировали с прямым праймером (5'-AAACAGACCACAGACCTGGTC-3 ') и обратным праймером (5'-AAGGATACCCCTCACACTCCCCATCCTCCCGGA TC-3'). Условия ПЦР были такими же, как для -308. Продукты ПЦР-238 расщепляли инкубацией с BamHi I (Gibco BRL, Life Technologies, MD, США) при 37 ° С в течение 2 часов. Для +489 (G → A) фрагмент в 550 п.н. амплифицировали с прямым праймером (5'-GGAGAGAAGCAACTACAGAC-3 ') и обратным праймером (5'-CACACTTAGTGAGCACCTTC-3'). Условия ПЦР были следующими: 10 мин при 95 ° С, затем 35 циклов: 30 с при 95 ° С, 30 с при 58 ° С и 30 с при 72 ° С. Окончательное удлинение проводили при 72 ° С в течение 10 мин. Продукты ПЦР расщепляли инкубацией с TaiI (MBI Fermentas) при 65 ° C в течение 3 часов. Фрагменты рестрикции (151 и 35 п.н. для -376 G и 186 п.н. для -376 A; 126 и 21 п.н. для -308 G и 147 п.н. для -308 A; 123 и 42 п.н. для -238 G и 165 б.п. для -238 A; 281, 159 и 111 п.н. для +489 G и 392 и 159 п.н. для +489 A) были разделены на 3% агарозном геле и визуализированы после окрашивания этидийбромидом.

Типирование DRB1 * 15, ассоциативный маркер для HLA-DR2, было выполнено с использованием собственных специфичных для последовательности праймеров, которые усиливают DRB1 * 1501, 1503, 1504, 1506 и 1507. 40 Все люди с системной красной волчанкой были набраны для их HLA-гаплотипы, как описано ранее. 41

статистический анализ

Для определения того, были ли аллели микросателлита TNFa связаны с различиями в индуцированной эндотоксином продукции TNF, был выполнен тест Крускала-Уоллиса, который не предполагает лежащего в основе распределения данных. Значимость определялась как значение вероятности менее 0, 05. Кроме того, медианную продукцию TNF сравнивали между носителями TNFa * 107 и не носителями TNFa * 107 с использованием теста Манна-Уитни.

Изучение того, связаны ли переносы TNF-полиморфизмов одиночных нуклеотидов G → A в положениях +489, -238, -308 и -376 относительно места начала транскрипции с продукцией TNF, средним продуцированием TNF гетеро- и гомозиготных носителей полиморфизмов (AG и АА соответственно) сравнивали с гомозиготными носителями дикого типа (GG) с использованием теста Манна-Уитни.

Оценивая, связана ли несущая HLA-DR2 с продукцией TNF, HLA-DR2-носители сравнивали с HLA-DR2-несущими с использованием теста Манна-Уитни. Кроме того, связь между различными гаплотипами HLA-DR и продукцией TNF была изучена среди лиц с системной красной волчанкой с использованием теста Крускала-Уоллиса.

Подтверждения

Мы благодарим А. Р. ван дер Слика за техническую помощь, М. В. ван дер Линдена за предоставление доступа к его данным и Департамент иммуногематологии и переливания крови за типирование HLA-гаплотипов.

Ген интерлейкина 4 полиморфизмIL-4C589T

Цитокины являются медиаторами межклеточных коммуникаций при иммунном ответе, гемопоэзе и развитии воспаления, эффекторами некоторых реакций иммунитета и служат связующим звеном между иммунной и другими системами организма. Ген IL-4 участвует в формировании иммунного ответа. Он играет большую роль во взаимодействии клеточных и гуморальных факторов иммунных и воспалительных реакций (оказывает противовоспалительное действие). IL-4 тормозитэкспрессию тканевого фактора, вызывая гипокоагуляцию и усиление секреции активатора плазминогена и подавляетдействие IL-1β, IL-6 и TNFα на эндотелиальные клетки и макрофаги, являющиеся основными триггерами гиперкоагуляции. IL-4 усиливает выработку IgE, что может провоцировать развитие аллергических реакций и воспаления дыхательных путей.

В то же время он повышает цитокинетическую активность макрофагов, способствует миграции в очаг воспаления нейтрофилов, усиливает выработку колониестимулирующих факторов. Вместе с другими факторами иммунного ответа он участвует во множестве иммунных реакций.

Наибольшее фунциональное значение имеет полиморфизм С589Т IL-4. В ряде исследований показана ассоциация полиморфизма с развитием ряда заболеваний, таких, как атопическая бронхиальная астма, муковисцидоз, инфаркт миокарда, эндометриоз, болезнь Крона.

Носители подобного гена обладают повышенной склонностью к активации иммунной системы при хирургических вмешательствах, инфекциях, механическом воздействии на ткань (забор яйцеклетки, подсадка зародыша при ЭКО). Наличие мутантного варианта гена предрасполагает к невынашиванию беременности. Кроме того, чаще развиваются осложнения сепсиса и других гнойно-воспалительных заболеваний.

Показания к анализу: предрасположенность к бронхиальной астме, муковисцидоз, болезнь крона, эндометриоз, инфаркт миокарда, невынашивание беременности, подготовка к беременности или ЭКО.

Мутация фактора некроза опухоли альфаTNFG308A

ФНО – это целое семейство цитокинов, осуществляющих свои функции через соответствующее семейство клеточных рецепторов. Биологические свойства ФНО чрезвычайно разнообразны и зависят от преобладания того или иного цитокина из его семейства. Основными являются: стимуляция продукции ИЛ-1, ИЛ-6 и самого ФНО, стимуляция процессов адгезии, антителообразования В-клетками, индукция колониеобразующих факторов эндотелиальными клетками и фибробластами, костимуляция Т-клеточной активации и ЕК-клеток. Входящие в семейство Fas-лиганд TRAIL индуцируют апоптоз, а лимфотоксины α и β играют важную роль в развитии лимфоидных органов. ФНОα влияет на процессы кроветворения, подавляя эритро-, миело- и лимфопоэз однако, на фоне подавленного кроветворения проявляется стимулирующее действие ФНОα. Индукция апоптоза и клеточной смерти цитокинами семейства ФНО является фундаментальной для использования их в лечении опухолей. Кроме возможности непосредственно вызывать цитолиз, ФНО также усиливает экспрессию на клеточной поверхности антигенов гистосовместимости ΙΙ класса и опухолеассоциированных антигенов, способствуя тем самым развитию более интенсивного иммунного ответа на опухоль.

Мутации в гене TNF передаются по наследству, как и предрасположенность к солидным опухолям, и являются своеобразными маркерами возможности их образования. Полиморфизм гена TNFA ассоциирован с уровнем экспрессии стероидных рецепторов на малигнизированных клетках молочной железы. Присутствие эстрогенового и прогестеронового рецепторов коррелирует с благоприятным прогнозом у больных РМЖ. Как выяснилось, секреция TNFA опосредуется аллельным состоянием гена. Существует корреляция между полиморфизмом гена TNFA и экспрессией стероидных рецепторов у больных РМЖ. Этот факт определяет важное взаимодействие эндокринной и иммунной системы. Действительно, генетическая возможность продуцировать более высокий уровень TNFA иммунными клетками и адипоцитами может регулировать уровень экспрессии прогестеронового рецептора опухолевыми клетками и, таким образом, влиять на опухолевую прогрессию.

TNFA аллель также связана с повышенным уровнем продукта гена в циркулирующей крови, что является противоопухолевым фактором . Этот цитокин определяет ответ иммунной системы на воспаление, также как и IL-4 он обладает противовоспалительной активностью.

Показания к анализу: бронхиальная астма, аллергии, рак молочной железы, эндометриоз, ожирение, сахарный диабет 2 типа, неванашивание беременности, подготовка к ЭКО.

COL1A1 (компонент коллагена 1-го типа)полиморфизмы +1245 G>T,-1997 G>T.

Ген COL1A1 кодирует основной компонент коллагена 1-го типа. Известно как минимум 9 типов молекул коллагена, волокна которых кодируются как минимум 17ю генами. Волокнистый коллаген является основным компонентом хрящевой ткани и входит в состав большинства других соединительных тканей. В исследованиях женщин было показана ассоциация полиморфизма со снижением плотности костной ткани (ПКТ) и увеличением числа остеопоротических переломов. Генотип G/T и T/T чаще встречался у пациентов с тяжелыми формами остеопороза и вертебральными переломами (54%), по сравнению с группой контроля (27%). Относительный риск вертебральных переломов у носителей мутантного аллеля Т составил 2.97.

У носителей варианта Т данного полиморфизма наблюдается нарушение нормального соотношения субъединиц в молекуле коллагена, что приводит к ухудшению его механических свойств. Вследствие этого носители варианта Т, особенно женщины в постменопаузе, гомозиготные по данному варианту, подвержены остеопорозу, костным переломам. Данные исследования демонстрируют, что полиморфизм в гене COLIA1 ассоциирован со снижением ПКТ и может предрасполагать к случайным переломам у женщин в постменопаузный период. Кроме того, мутации в данном гене ассоциированы с развитием незавершенного остеогенеза, синдромом Элерса-Данло и идиопатическим (спонтанным) остеопорозом.

Показания к анализу: Остеопороз в семейном анамнезе.

VDR (рецептор витамина D)полиморфизмы+61968T>C, -3731А>G.

Важную роль в прогрессировании остеопороза играют нарушения в метаболизме и снижении чувствительности к витамину D. Вместе с COL1A1 VDR принадлежит ключевая роль в остеогенезе и минеральном обмене. В ряде исследований показана ассоциация полиморфизма VDR с возникновением переломов. Была выявлена ассоциация между увеличением частоты аллеля гена у женщин с впервые зарегистрированными переломами. Аллельный вариант ассоциирован с риском развития остеопороза, возникновением переломов.

Показания к анализу. Остеопороз в семейном анамнезе.

Читайте также: