Экспрессия генов при раке молочной железы

28 сентября 2014

  • 3659
  • 3,0
  • 0
  • 0

История о том, как мировой секс-символ познакомилась со словами BRCA1 и CHEK2. В коллаже использована схема участия белков BRCA в репарации ДНК.


  • Анна Петренко

    • Антон Чугунов

    • Андрей Панов



    Профилактическая мастэктомия — один из наиболее эффективных и дискуссионных способов предупреждения рака груди. Хотя распространенность наследственного рака невысока (10–15% от всех случаев РМЖ), шанс заболеть у женщин-носительниц предполагаемых мутаций повышается — вплоть до почти 100% вероятности в некоторых случаях. Роковые цифры рассчитывают для каждой пациентки индивидуально.


    Число женщин, выбирающих превентивную мастэктомию, увеличивается с каждым годом. В Англии, по данным NHS (национальной системы здравоохранения), операцию на здоровых железах в 2002 году провела 71 пациентка, а в 2011 — уже 255 [1].

    Частота подобной операции больше всего растет в США: как сообщил Доктор Келли Хант на ежегодной конференции американского общества клинической онкологии (ASCO), в 2010 году в Anderson Cancer Center (Хьюстон, США) здоровые железы удалили 8% пациенток, в 2011 году — 12,6%, в 2012 — уже 14,1% [2]. Что же это: массовая истерия или разумный выход из положения?

    Отеческая забота

    ДНК под микроскопом


    Рисунок 2. Генетическая структура рака молочной железы. Слева: Генетическая предрасположенность к развитию рака груди составляет около 10–15% от всех случаев РМЖ, причем высокопенетрантные гены ответственны примерно за четверть опухолей, передающихся по наследству. Справа: Соотношение основных генов, мутации в которых задействованы в развитии наследственного РМЖ: среди известных генов BRCA1 и 2 занимают лидирующую позицию.

    Высокопенетрантные гены

    Еще в начале 90-х годов BRCA1 и BRCA2 были идентифицированы как гены предрасположенности к раку молочной железы и раку яичников. Они находятся в длинных плечах 17-й и 13-й хромосом и имеют 24 и 27 экзонов соответственно, причем мутации чаще всего встречаются в самом крупном — одиннадцатом экзоне. Ортологи BRCA1 и BRCA2 определены и у других млекопитающих; всего в генах BRCA зарегистрировано свыше 2000 (!) различных мутаций, среди которых есть и делеции, и вставки, и замена одиночных нуклеотидов.

    Помимо рака молочной железы, мутации в гене BRCA1 проявляются при раке яичников, причем оба типа опухолей развиваются в более раннем возрасте, чем при ненаследственном РМЖ. BRCA1-ассоциированные опухоли в целом связаны с неблагоприятным прогнозом для пациентки, поскольку чаще всего относятся к трижды негативному РМЖ. Этот подтип назван так из-за отсутствия в клетках опухоли экспрессии сразу трёх генов — HER2, рецепторов эстрогенов и прогестерона, поэтому и лечение, основанное на взаимодействии лекарств с этими рецепторами, невозможно.

    Наиболее распространены мутации в BRCA1/2 у евреев Ашкенази. Мутации, характерные для определенных сообществ и географических групп, описаны также и для жителей нашей страны. Так, в России мутации BRCA1 представлены в основном пятью вариациями, 80% из которых — 5382insC. Мутации генов BRCA1 и BRCA2 приводят к хромосомной нестабильности и злокачественной трансформации клеток молочной железы, яичников и других органов. Кумулятивный риск рака молочной железы и яичников у всех женщин с мутацией BRCA1/BRCA2 на протяжении всей жизни оценивается как минимум в 60–80% (средний суммарный риск — 65% для BRCA1 и 45% для BRCA2). Однако, обращают внимание ученые, едва ли не большинство случаев семейного РМЖ и рака яичников невозможно объяснить уже изученными мутациями, поэтому биологи изучают возможные вариации в других генах, контролирующих клеточный цикл.

    Гены с умеренной и низкой пенетрантностью

    Большинство умеренно- и низкопенетрантных генов напрямую взаимодействует с BRCA1 (например, BARD1, ABRAXAS, BRIP1, BABAM1), следовательно, их поломки мешают ему нормально выполнять свою работу.

    Белок, кодируемый геном ATM, выполняет множество функций, связанных с ответом на повреждение и с репарацией ДНК, в том числе в сигнальных путях, включающих TP53, BRCA1 и CHEK2.


    Рисунок 3. Белковый комплекс репарации ДНК. На заключительном этапе — гомологической рекомбинации — требуются Rad51 и RAD51C и их взаимодействие с BRCA1 и BRCA2. RAD51C также активирует CHEK2. Окраска белков соотносится в мутациями в соответствующих генах, отвечающих за развитие заболевания: анемия Фанкони (красный), детские солидные опухоли (зеленый), РМЖ (темно-синий), рак яичников (светло-голубой). Ub — убиквитин.

    Поскольку до 90% смертей от рака вызваны не первичной опухолью, а ее метастазами, то наиболее интересная тема научной дискуссии — это изучение активности генов в метастазах. Пока корреляция между наследственными факторами, агрессивностью опухоли и ее способностью к метастазированию не подтверждена: исследований конкретно этой связи практически нет, но это не значит, что связь отсутствует. К примеру, в некоторых работах установлено, что риск метастазирования увеличивается при наличии, например, полиморфизмов в генах Rrp1b и SIPA1, а также и гомо- или гетерозиготности по ним [8].

    Изучение метастатических ниш в будущем может указать не только на орган, но и на месторасположение будущего метастаза в этом органе, уверены исследователи.

    Профилактика РМЖ

    Превентивный подход предусматривает несколько альтернатив [10]:

    1. самостоятельное обнаружение уже появившегося рака на ранней стадии (регулярные маммографические и МРТ обследования, самообследование груди на предмет опухоли);
    2. двухсторонняя радикальная мастэктомия;
    3. профилактическая овариэктомия / сальпинго-овариэктомия — удаление яичников/яичников и матки;
    4. химиопрофилактика (пока что все еще находится в процессе разработки и изучения).

    Значимо выигрывают, к сожалению, только те, кто прошел через удаление и молочных желез, и яичников. Ученые считают, что если психологический гнет для женщины слишком силен, у нее уже есть дети и ее не устраивает длительный прием препаратов, то радикальные операции могут быть оптимальным решением — ведь после них пациентка может вести более-менее нормальную жизнь.

    Например, профилактическая сальпинго-овариэктомия в зависимости от возраста пациентки может снизить вероятность возникновения рака от 60% до 90%: на 75–96% рака яичников и фаллопиевых труб и примерно на 50% — риск РМЖ, если ее провели до менопаузы [11]. Однако принимая во внимание предпочтения и качество жизни женщин, удаление яичников рекомендуют делать лишь после 40 лет, и если угроза жизни действительно высока.

    Пиар и пустоцвет

    Список генов, связанных с развитием опухоли и метастазированием, значительно расширен. Найдены новые взаимодействия белков, уточнены сигнальные пути и механизмы защиты нормального функционирования ДНК, внесены свежие данные по возникновению ракового перерождения. Новые технологии секвенирования помогут сделать еще не одно открытие и создать новые пути применение генетики для продления и спасения жизней.

    Установление ассоциации экспрессии генов семейства GST и клинико-морфологических характеристик у пациенток с отечно-инфильтративным и первично-диссеминированным раком молочной железы

    Следует отметить, что в представленных исследованиях при изучении роли глутатион-S-трансферазы (GST) в разивитии химиорезистентности при раке молочной железы (РМЖ) проводилось определение полиморфизма генов GST у пациенток с раком молочной железы, а также иммуногистохимическое определение экспрессии изоферментов GST, однако не проводилось определения экспрессии генов суперсемейства GST.

    В качестве материала для исследования использованы парафинфиксированные срезы образцов опухолевой ткани пациенток.

    Таблица 8. Экспрессия генов семейства GST у пациенток с ОИФ РМЖ (сТ4N0-3М0)


    Таблица 9. Экспрессия генов семейства GST у пациенток с раком молочной железы с наличием отдаленных метастазов (сТлюбаяТлюбаяМ1, IV стадия)


    Расчет процента уровня нормализованной экспрессии генов семейства GST проводился по формуле:

    2 - (Ct интересующего гена образца - Ct гена HGUS образца) х 100%,

    где Ct - пороговый цикл (cycle threshold).

    В связи высоким процентом отсутствия экспрессии гена GSTM1 (63,3%) у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ при статистической обработке данный ген рассматривался как номинальный.

    При анализе взаимосвязи экспрессии генов семейства GST с гормон-рецепторным статусом опухоли у пациенток с ПД РМЖ (табл. 10) определены статистически значимые различия в нормализованной экспрессии гена GSTP1 в зависимости от эстроген- (p = 0,002) и прогестерон-рецепторного статуса (p = 0,001): так в эстроген- и прогестерон-негативных опухолях отмечена более высокая экспрессия данного гена, чем в эстроген- и прогестерон-позитивных новообразованиях (рис. 21), что согласуется с данными W. H. Peters (1993), L. Gilbert (1993), R. Silvestrini (1997).

    Таблица 10. Экспрессия генов GST в зависимости от гормон-рецепторного статуса опухоли у пациенток с IV стадией РМЖ




    Рис. 21. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от рецепторного статуса опухоли у пациенток с раке молочной железы IV стадии

    Следует отметить, что определение экспрессии GSTP1 в данных исследованиях проводилось иммуногистохимическим методом. При этом у пациенток с ОИФ РМЖ данная ассоциация экспрессии гена GSTP1 с гормон-рецепторным статусом опухоли отсутствовала. Для генов GSTM1 и GSTT1 статистически значимых различий в экспрессии у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ в зависимости от рецепторного статуса опухоли выявлено не было.

    При анализе взаимосвязи нормализованной экспрессии генов GST с экспрессией белка Her2neu в опухоли у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ статистически значимых различий в экспрессии в зависимости от рецепторного статуса опухоли выявлено не было. При этом в исследованиях A. Romero и S. Lizard-Nacol также не найдено ассоциации между экспрессией GSTT1, GSTM1 и характеристиками опухолевого процесса, а в исследованиях C. Bellamy, R. L. Franco и J. Huang не выявлено ассоциации экспрессии GSTP1 и онкобелка Her2-neu.

    Выявлены статистически значимые различия в нормализованной экспрессии гена GSTP1 в зависимости от молекулярно-генетических подтипов опухоли (рис. 22) у пациенток с ПД РМЖ (p = 0,005).



    Рис. 22. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от молекулярно-генетических подтипов опухоли у пациенток с ПД РМЖ

    Так люминальный подтип опухоли характеризуется низкой нормализованной экспрессией гена GSTP1 (73,22% (9,31-1611,13%)), в то время как при базальноподобном подтипе опухоли наблюдается высокая экспрессия гена GSTP1 (284,87% (15,5-912,61%)). Для других генов семейства GST статистически значимых различия в нормализованной экспрессии генов выявлено не было (p > 0,05).

    Полученные данные согласуются с результатами исследования T. Miyake et al., согласно которым люминальный А-, люминальный B- и HER2-позитивные злокачественные новообразования были значительно реже 08ТР1-позитивны (по данным иммуногистохимического метода исследования), чем базальный тип опухолей (р = 0,002, p 0,05). Для других генов семейств GST у пациенток с ОИФ и ПД РМЖ статистически значимых различии в нормализованной экспрессии генов в зависимости от гистологических параметров опухоли выявлено не было (p > 0,05).

    Определены статистически значимые различия в экспрессии гена GSTT1 у пациенток с ОИФ РМЖ в зависимости от вовлеченности в опухолевый процесс регионарного лимфатического аппарата (p = 0,037) (табл. 11): при более распространенном опухолевом поражении cN3 отмечена более низкая экспрессия гена GSTT1 (12,76% (0-75,79%)), при этом данная зависимость у пациенток с ПД РМЖ отсутствовала (p > 0,05). В проведенных ранее исследованиях не выявлено взаимосвязи между экспрессией гена GSTT1 и поражением лимфатического коллектора.

    Таблица 11. Экспрессия генов семейства GST в зависимости от степени поражения лимфатического аппарата (cN) у пациенток с ОИФ РМЖ


    При анализе взаимосвязи нормализованной экспрессии генов семейства GST с размерами первичного очага (табл. 12) статистически значимые различия в нормализованной экспрессии выявлены для гена GSTP1 (p = 0,041) у пациенток с ПД РМЖ.

    Таблица 12. Экспрессия генов GSTв зависимости от размеров первичного очага и поражения регионарных лимфатических узлов у пациенток с раком молочной железы IV стадии


    При распространении первичной опухоли на грудную стенку и/или кожу (Т4) отмечена более высокая экспрессия гена GSTP1 (202,1% (9,31-1611,13%)) (рис. 23). Для других генов семейства GST статистически значимых различия в нормализованной экспрессии генов в зависимости от размеров первичного очага выявлено не было (p > 0,05).



    Рис. 23. Экспрессия гена GSTP1 в зависимости от размеров первичного очага у пациенток с раком молочной железы IV стадии

    Полученные данные о более высокой экспрессии гена GSTP1 у пациенток с ПД РМЖ при сТ4 (p = 0,041) находятся в соответствии с результатами исследования B. V. Jardim, в котором продемонстрировано, что высокий уровень экспрессии 08ТР1 (по данным иммуногистохимического метода исследования) был ассоциирован с III стадией и большим размером новообразования (р 0,05) (табл. 13).

    Таблица 13. Ассоциация экспрессии генов семейства GST с общей выживаемостью и выживаемостью без прогрессирования у пациенток с ОИФ РМЖ


    При унивариантном анализе влияния экспрессии генов семейства GST на общую выживаемость у пациенток с ПД РМЖ, получавших как часть специального лечения полихимиотерапии (ПХТ) с включением антрациклинов (табл. 14), статистически значимых различий выявлено не было (p

    План лечения составляют с учётом стадии опухолевого процесса, морфологической структуры опухоли, возраста больной, сопутствующих заболеваний, общего состояния пациентки. Применяют следующие методы лечения: хирургический, комбинированный (сочетание операции с лучевой или лекарственной терапией) и ком.

    По данным многочисленных публикаций, этиология и патогенез РМЖ сложны и определяются сочетанием многих факторов. Гормональная регуляция функции молочных желез значительно сложнее, чем эндометрия. Помимо эстрогенов и прогесторона, развитие молочных желез в пубертатном периоде, их функция во время бер.

    Гистологическую градацию рака молочной железы впервые ввел R.B. Greenough из Бостона, который в 1925 г. опубликовал анализ 73 случаев рака молочной железы. Несмотря на то что прошло много времени и опубликовано большое количество работ о применении гистологической градации рака молочной железы, ниче.

    При анализе данных, получаемых с помощью ультразвукового исследования, целесообразно выделить ряд диагностических задач, решение которых позволит получить полный комплекс эхографических признаков рака молочной железы и метастатических лимфатических узлов, по которым в дальнейшем будет производиться .

    Патологические процессы в молочной железе отличаются многообразными клиническими проявлениями, что норой создает серьезные дифференциально-диагностические трудности. Для гипеколога важнее всего заметить (не пропустить!) патологию молочных желез, что приведет в движение систему методов уточня.

    Доброкачественные изменения молочных желез относятся к наиболее распространенным заболеваниям и включают различные по клиническим, морфологическим и этиологическим признакам процессы. Отличительной особенностью молочной железы является сложность четкой дифференцировки физиологических и патологически.

    Рак молочной железы развивается из эпителия млечных протоков и альвеол. Патоморофологическая характеристика рака молочной железы включает такие параметры, как размер первичного очага, его локализацию в молочной железе, тип роста, морфологическое строение, степень дифференцировки, наличие регионарных.

    Это статья с открытым доступом, распространяемая в соответствии с лицензией Creative Commons Attribution License (), которая допускает неограниченное использование, распространение и воспроизведение на любом носителе при условии, что оригинальная работа была правильно указана.

    Важность микроокружения опухоли при раке молочной железы все чаще признается. Однако критические молекулярные изменения в строении опухоли, сопровождающие прогрессирование рака, остаются в значительной степени неизвестными. Мы провели сравнительный анализ глобальных изменений экспрессии генов в стромальных и эпителиальных отделениях во время прогрессирования рака молочной железы от нормального до преинвазивного до инвазивного протокового рака.

    Мы объединили микродиссецию лазерного захвата и микроматрицы экспрессии генов, чтобы проанализировать 14 нормальных эпителий, нормальный строма, опухолевый эпителий и связанные с опухолью стромы. Проводились дифференциальная экспрессия генов и анализы онтологии генов.

    Опухолевая строма подвергается обширным изменениям экспрессии генов при прогрессировании рака, в той же степени, что и в злокачественном эпителии. Высоконапряженные гены в связанной с опухолью строме включают компоненты внеклеточного матрикса и матричные металлопротеазы и гены, связанные с клеточным циклом. Снижение экспрессии цитоплазматических рибосомных белков и повышенная экспрессия митохондриальных рибосомных белков наблюдались как в опухолевом эпителии, так и в строме. Переход от преинвазивного к инвазивному росту сопровождался увеличением экспрессии нескольких матричных металлопротеаз (MMP2, MMP11 и MMP14). Кроме того, как отмечено в злокачественном эпителии, в строме также присутствует сигнатура экспрессии генов гистологической опухолевой степени, при этом высокоразмерные опухоли связаны с повышенной экспрессией генов, участвующих в иммунном ответе.

    Наши результаты показывают, что микроокружение опухоли участвует в опухолегенезе даже до того, как опухолевые клетки проникают в строму и что она может играть важную роль в переходе от преинвазивного к инвазивному росту. Иммунные клетки в стромальной опухоли могут быть использованы злокачественными эпителиальными клетками в высокосортных опухолях для агрессивного инвазивного роста.

    См. Соответствующую редакционную статью Schedin и Borges,

    Микроокружение опухоли или строма, несущая злокачественные эпителиальные клетки груди, состоят из нескольких типов клеток, включая фибробласты, миоэпителиальные клетки, эндотелиальные клетки и различные иммунные клетки 4. Одно из преобладающих представлений заключается в том, что связанная с опухолью строма активируется злокачественными эпителиальными клетками для стимулирования роста опухоли — например, путем секреции факторов роста, увеличения ангиогенеза и облегчения миграции клеток, что в конечном итоге приводит к метастазированию в отдаленные участки органов [3]. Например, недавно было показано, что два хемокина (хемокиновый (CXC мотив) лиганд (CXCL) 12 и CXCL14), которые связываются с опухолевыми эпителиальными клетками, чтобы способствовать пролиферации, миграции и инвазии, были сверхэкспрессированы активированными опухолевыми фибробластами и миоэпителиальными клетками [5- 7]. Таким образом, гены, участвующие в взаимодействиях с опухолью-микроокружением, могут создавать новые цели для диагностического развития и терапевтического вмешательства. Однако наше понимание взаимодействия между эпителиальными и стромальными компонентами рака молочной железы остается ограниченным на молекулярном уровне. Используя последовательный анализ метода экспрессии генов, Allinen и соавторы провели первое систематическое профилирование различных типов стромальных клеток, выделенных клеточными клеточными маркерами поверхности и магнитными шариками [7]. Они продемонстрировали изменения генной экспрессии во всех типах клеток в микроокружении опухоли, сопровождающие прогрессию от нормальной ткани молочной железы до карциномы протоков in situ (DCIS), к инвазивной герцогической карциноме (IDC) [8], что свидетельствует о том, что эти типы клеток все участвуют в опухолегенезе.

    Используя микродиссекцию лазерного захвата (LCM), мы ранее проводили анализ экспрессии генов эпителиального отдела злокачественных поражений при прогрессировании рака молочной железы. Мы обнаружили, что большинство изменений экспрессии генов происходит до локального вторжения (даже при атипичной гиперплазии протоков) и что нет существенных изменений в экспрессии генов, сопровождающих in situ, до инвазивного перехода роста [9]. В настоящей статье мы распространим этот анализ на микроокружение опухоли стромы и продемонстрируем, что микрофлора опухолевого строма, как и опухолевый эпителий, подвергается обширным изменениям экспрессии генов даже на преинвазивной стадии DCIS, что подтверждает мнение о том, что связь клеток с клетками между двумя отделениями играет важную роль в прогрессировании опухоли.

    Все образцы рака молочной железы были свежезамороженными биопсиями, полученными в Больнице штата Массачусетс в период с 1998 по 2001 год. Диагностические критерии и классификация опухолей были описаны ранее [9]. Характеристики пациента и опухоли 14 опухолевых образцов в этом исследовании представлены в таблице 1. Были отобраны пациенты, у которых были сопоставлены пациенты с нормальными и опухолевыми образцами, и нормальные грудные дольки не проявляли фиброзно-кистозных изменений. Исследование считалось освобожденным от информированного согласия, поскольку образцы не идентифицируются с исследовательской группой. Исследование было одобрено комиссией по исследованиям в больнице штата Массачусетс в соответствии с руководящими принципами исследования научных исследований Национального института здоровья.

    Характеристики пациентов и опухолей образцов в исследовании

    ND, не определено; N / A, недоступно.

    Высокообогащенные популяции пациентов с соответствующими нормальными или злокачественными эпителиальными клетками и нормальной стромой или опухолесодержащей стромой с разных этапов прогрессирования рака молочной железы были закуплены LCM с использованием системы PixCell IIe (Molecular Devices, Mountain View, CA, USA), поскольку ранее описанных [9]. Обогащение для клеток, представляющих интерес, было подтверждено микроскопическим исследованием колбы LCM после микродиссекции. Микроразрушенный нормальный стромальный отдел состоял из внутриполостного, а не экстралобулярного стромального отделения нормальной ткани молочной железы, которое составляло минимум 0,3 см от любого предракового или злокачественного поражения (рис. 1). Строма, связанная с DCIS (DCIS-S), состояла из обода размером 25 мкм, который окружал DCIS; для случаев, когда присутствовали синхронные DCIS и IDC, DCIS-S был получен из областей DCIS, которые были на расстоянии не менее 0,3 см от инвазивного компонента. Связанная с IDC строма (IDC-S) состоит из стромальных клеток, преимущественно внутри инвазивной опухолевой массы.

    Экспериментальный дизайн микродиссекции лазерного захвата. Пример отсеков микроокружения опухоли, предназначенных для микродиссекции лазерного захвата: эпителиальная (белая звездочка) и стромальные (черные очерченные области с черной звездочкой) отсеки нормального концевого проточного лобулярного блока, карциномы протоков in situ (DCIS) и инвазивной проточной карциномы ( IDC).

    Общая РНК была выделена из захваченных клеток с использованием набора для выделения РНК Picopure ™ (Molecular Devices), амплифицированного с помощью амплификации T7 РНК (RiboAmp ™, Molecular Devices), маркированной и гибридизованной со всей матрицей генома U133X3P (3′-смещенная конструкция) в соответствии с инструкции изготовителя (Affymetrix, Санта-Клара, Калифорния, США). Затем гибридизованные микрочипы промывали, окрашивали и отсканировали в соответствии с протоколами изготовителя (Affymetrix).

    Исходные данные из массивов U133X3P обрабатывались с использованием пакета rma Bioconductor с параметрами по умолчанию для коррекции фона, нормализации квантилей и суммирования сигналов [10,11]. Дифференциальные анализы экспрессии генов выполнялись с использованием моделей линейной регрессии в пакете limma [12]. Для сравнения нормальных и опухолевых образцов мы использовали идентификацию пациента как блокирующую переменную. Для сравнения уровня опухоли мы использовали стадию опухоли (in situ или инвазивную) в качестве блокирующей переменной. Статистическая значимость была скорректирована для множественного тестирования с использованием процедуры Бенджамини-Хохберга [13]. Все процедуры были выполнены в статистической среде R [14]. Для анализа онтологий генов ранжированные списки генов сначала генерировались в соответствии с модерируемой статистикой t из линейных моделей, а затем изучались для обогащенных терминов онтологии с использованием программного обеспечения для анализа обогащения гена [15]. Данные, обсуждаемые в этой публикации, были депонированы в выводе гена NCBI Omnibus [16] и доступны [GEO: GSE14548] [17].

    TaqMan ™ в режиме реального времени ПЦР выполняли на амплифицированной РНК, используемой для анализа микрочипов, как описано ранее [9]. Вкратце, амплифицированную РНК превращали в двухцепочечную кДНК, а кДНК количественно определяли с помощью PicoGreen (Molecular Probes, Eugene, OR, USA) с использованием спектрофлуорометра (Molecular Devices). Каждый ген анализировали в трех повторностях в 96-луночном планшете с использованием ABI 7900 HT (Applied Biosystems, Foster City, CA, США).

    Для каждого гена последовательностей пар праймеров ПЦР и флуорогенных зондов MGB или TAMRA (соответственно 5 ‘- 3’) являются следующими: ESR1, ATGATCAACTGGGCGAAGA, GGTGGACCTGATCATGGA и VIC-TGCCAGGCTTTGTGGA; RRM2, CCTTTAACCAGCACAGCCAGTT, TTATTTGTTTGTAAAGTGCCAGGTTT и VIC-TGCAGCCTCACTGCTTCAACGCA-TAMRA; гремлин 1 (GREM1), ACGGCAAAGAATTATATAGACTATGAGGTA, TTTTATGAGACTATCAACTCCCCTTTC и VIC-CTTGCTGTGTAGGAGGA; и ингибитор WNT 1 (WIF1), CACTGTGGTAGTGGCATTTAAACAATA, GCCAATGCAAAAAGTTCATACATT и VIC-TTCTAAACACAATGAAATAGGGA.

    Эфирное рецепторное и прогестероновое рецепторное иммуногистохимическое окрашивание выполняли, как описано ранее, с использованием моноклонального антитела кролика (SP1) от Lab Vision (Fremont, CA, USA) для рецептора эстрогена (разведение 1:50) и с использованием мышиного моноклонального антитела (PgR 636 ) от Dako (Carpinteria, CA, USA) для рецептора прогестерона (разведение 1:50) [18].

    Настоящее исследование включало 14 пациентов с первичным раком молочной железы протоков (Таблица 1). Эти пациенты были в основном положительными на рецепторы эстрогена (78,6%), положительными на лимфатические узлы (78,6%) и предклимактерическими (средний возраст 41 год). Мы использовали LCM для изолирования отделов эпителия и стромы отдельно от каждой из 14 свежезамороженных биопсий. В эпителиальном отделении мы взяли нормальный и злокачественный эпителий из DCIS и / или IDC. В стромальном отделении мы фиксировали нормальную строму как минимум на 3 мм от злокачественного поражения и DCIS-S и / или IDC-S, когда это было возможно. Пример микродиссифицированных отделений показан на рисунке 1. Как показано в таблице 2, в эпителиальном отделении четыре случая имели все три стадии (нормальный грудной эпителий, DCIS и IDC), пять случаев имели нормальный грудной эпителий и только IDC, и пять случаев имели нормальный грудной эпителий и только DCIS; в строме шесть случаев имели все три стадии, пять случаев имели нормальное стромальное отделение и DCIS-S, а три случая имели нормальное стромальное отделение и IDC-S. РНК была выделена из захваченных клеток и опрошена с помощью массива целых геномов Affymetrix U133X3P.

    Микродиссекция лазерного захвата 14 пациентов с первичным раком молочной железы

    x, компонент захвачен.

    Мы сравнили образцы экспрессии генов опухолевого эпителия и стромы на каждой стадии прогрессирования (DCIS или IDC) с их соответствующим нормальным состоянием с использованием программного пакета limma (линейные модели микрочипов) [12]. Полученные значения Р для дифференциальной экспрессии генов в каждом парном сравнении были скорректированы для множественного тестирования [13], и были извлечены гены со значительным скорректированным значением Р (Р 3-кратной дифференциальной экспрессией в карциноме протоков in situ (DCIS) по сравнению с нормальной грудной или инвазивной протоковой карциномой (IDC) по сравнению с нормальной грудью в эпителии. (b) Тепловая карта из 557 генов с> 3-кратной дифференциальной экспрессией в карциноме протоковой карциномы, связанной с in situ (DCIS-S), по сравнению с нормальным стромальным отделением или с инвазивной строкой, связанной с проточной карциномой (IDC-S), по сравнению с нормальным стромальным отделением. Показанные данные: log2 (изменение складки) относительно среднего выражения в нормальных элементах контроля (нормальный грудной эпителий или нормальное стромальное отделение). В каждой тепловой карте гены (ряды) группируются иерархически с использованием соотношения 1 — Пирсона в качестве метрики расстояния. IS, протоковая карцинома in situ; INV, инвазивная протоковая карцинома; МКС, протоковая карцинома, связанная с in situ строма; INVS, инвазивная строма, связанная с проточной карциномой.

    Чтобы получить обзор биологических процессов, в которых участвуют эти дифференциально экспрессируемые гены, мы провели анализ обогащения генов [19] с использованием базы данных онтологии генов [20]. В таблице 3 представлены термины онтологии 20-го поколения, которые значительно обогащены генами, усиленными на инвазивной стадии эпителия и стромы. В эпителии в генах доминировали те, которые связаны с клеточным циклом (в частности, митозом). В строме гены заметно отличались компонентами внеклеточного матрикса и матричных металлопротеаз, ответственных за ремоделирование внеклеточного матрикса. Кроме того, стромальные гены также включали те, которые связаны с клеточным циклом, что указывает на увеличение пролиферации в качестве общей черты как в опухолевом эпителии, так и в строме.

    Топ-20 генных онтологических терминов, обогащенных опухолевым эпителием и стромой

    В обоих отделениях однотипный онтологический термин STRUCTURAL_CONSTITUENT_OF_RIBOSOME был значительно обогащен нисходящими генами (таблица 3). Чтобы изучить это далее, мы извлекли все гены, кодирующие рибосомальный белок, которые были дифференциально экспрессированы между DCIS или IDC по сравнению с нормальной грудью в эпителии и визуализировали их образцы экспрессии в обоих отделениях. Интересно, что было почти полное двудольное разбиение этих генов (рис. 4): в то время как нисходящие гены были все, кодирующие цитоплазматические рибосомальные белки, усиленные гены были в основном теми, которые кодируют митохондриальные рибосомные белки.

  • Читайте также: