Диагностика лейкоза крс методом пцр

Диагностика вируса лейкоза крупного рогатого скота

Для диагностики лейкоза применяют клинический, патологоанатомический, гистологический, гематологический, серологический и молекулярно - биологический методы.

Клиническая диагностика осуществляется регистрацией вышеуказанных специфических и неспецифических признаков. Большинство исследователей указывают на первичное появление неспецифических признаков, а затем появляются специфические, по которым можно поставить диагноз.

При патологоанатомическом исследовании трупов животных выявляют увеличение лимфатических узлов, особенно средостенных и брыжеечных, которые не спаяны между собой. Поверхность разреза их саловидная, рисунок строения слегка или совсем стерт. Селезенка увеличена (длиной от 48 до 100 см). Поверхность разреза ее красная, сочная, зернистая. Увеличенные фолликулы обычно вишнево-красного или сероватого цвета. Они возвышаются над поверхностью разреза. У некоторых животных фолликулы могут быть малиново-красного цвета. Макроскопических изменений в почках обычно не выявляют. Однако иногда можно наблюдать сероватую бугристость размером от 1 до 5 мм и более.

При гистологическом исследовании выявляют системную диффузную лейкозную инфильтрацию во всех органах кроветворения: костном мозге, селезенке, лимфатических узлах, а также в пейеровых бляшках и солитарных фолликулах кишечника, печени, почках, сердце, легких, скелетной мускулатуре.

Гематологический метод позволят диагностировать лейкоз на более ранних стадиях развития заболевания. Сущность его заключается в обнаружении в периферической крови повышенного числа лейкоцитов (в основном лимфоидного ряда), слабо дифференцированных клеток, а также полиморфных, атипичных клеток кроветворных органов. Для оценки результатов исследований в различных странах предложено несколько вариантов "лейкозных ключей". В нашей стране в 1965 году был разработан отечественный "лейкозный ключ". Все лимфоидные диагностические "ключи" основаны на количественных показателях.

Заражение животных ВЛКРС сопровождается выработкой антител к структурным белкам вируса. Антитела и вирус персистируют в организме у зараженных животных на протяжении всей жизни. Это позволяет применять серологические методы для диагностики инфекции, вызываемой этим вирусом.

К серологической диагностике лейкоза в стране приступили с 1985 года. При этом ежегодно увеличивается число животных, подвергаемых серологической диагностике. Во многих хозяйствах, даже с высоким уровнем инфицированности, этот метод хорошо себя зарекомендовал, а его использование позволило полностью оздоровить стада. Однако РИД - исследованиями проверяется по многим регионам около 50% поголовья. Лишь в Архангельской, Курганской, Ленинградской, Вологодской, Пермской, Удмуртской и Московской области проверяются все животные. Низкий охват серологическими исследованиями поголовья в других регионах означает, что нет полной ясности об уровне инфицированности стада, а значит, нет четких планов оздоровления.

Как правило, в данной тест-системе используется смесь белков, среди которых преобладают gp 51 и р 24, однако с ее помощью преимущественно выявляются антитела к gp 51. Данный метод достаточно простой, позволяет получить надежные результаты и, поэтому широко введен в ветеринарную практику. Основными его недостатками являются невысокая чувствительность и длительность анализа. Как известно, время анализа этим методом, получившим в свое время в ветеринарной практике название метода Оухтерлони, или РИД, занимает 2-3 суток, а результат регистрируется визуально по наличию полосы преципитации.

Метод не прямого иммуноферментного анализа (ИФА), основанный на применении антивидового конъюгата с использованием ферментов-маркеров, обладает значительно большей чувствительностью, по сравнению с РИД, позволяет автоматизировать процесс, то есть уйти от субъективной оценки результатов реакции. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в молоке и моче.

C целью полного оздоровления популяции КРС от лейкоза, целесообразно на последней стадии оздоровления исследовать все поголовье методами, выявляющими непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных. С этой целью можно использовать прямой иммуноферментный анализ (ИФА), позволяющий детектировать непосредственно антигенные детерминанты.

Полимеразная цепная реакция (ПЦР) - это метод амплификации в пробирке, с помощью которого в течение нескольких часов можно выделить и размножить определенную последовательность провирусной ДНК в количестве, превышающем исходное в 10 миллионов раз. Такая высокая степень направленного обогащения значительно упрощает использование имеющегося образца ДНК.

Некоторые области применения ПЦР - высокоэффективное клонирование геномных последовательностей, анализ происхождения групп скота, прямое сиквенирование митохондриальной и геномной ДНК, анализ вариаций нуклеотидных последовательностей и выявление вирусных и бактериальных патогенов.

Для присоединения и начала работы ДНК - полимеразы необходимо наличие спаренного 3’ - конца. В клетке ферментом РНК - праймазой синтезируется РНК - затравка (праймер), состоящий примерно из 10 нуклеотидов. Эти РНК - затравки и наращивает ДНК - полимераза .

При амплификации с помощью ПЦР используют два олигонуклеотидных ДНК - праймера, фланкирующие интересующий нас участок ДНК. Процесс амплификации заключается в повторяющихся циклах температурной денатурации ДНК, отжига праймеров с комплементарными последовательностями и последующей достройки полинуклеотидных цепей с этих праймеров ДНК - полимеразой (см. приложение Б). Длинные фрагменты, синтезируемые на исходной цепи, накапливаются по формуле арифметической прогрессии. В противоположность этому - короткие дискретные фрагменты, ограниченные на концах праймерами, которые появляются только в конце третьего цикла, накапливаются в геометрической прогрессии и очень скоро начинают доминировать среди продуктов амплификации.

Праймеры для амплификации выбираются в различных частях генома: 5΄LTR, gag, env, Х - области. Именно подбор праймеров - основных компонентов тест - систем определяет их специфичность, точность и надежность. Основными критериями высококачественной тест - системы являются в первую очередь степень гомологии праймеров, отсутствие самокомплементарных участков внутри ампликона и праймеров, а так же близость значений температуры плавления праймеров. Температура плавления праймеров вычисляется по формуле:

где А, Т, Г, С - количество, соответственно адениновых, тиминовых, гуаниновых, и цитозиновых оснований в составе праймера.

Термин "100% - степень гомологии" означает, что для всех известных изолятов (то есть для тех, которые присутствуют в базах данных EMBL, GenBank, DDBJ) уровень гомологии составляет 100%.

Нельзя подбирать праймеры на те области, которые могут иметь делеции при интеграции в геном хозяйской клетки. Показано, что с помощью праймеров из области гена env GP 51 провирусную ДНК вируса лейкоза удавалось обнаруживать как в лимфоцитах перифирической крови инфицированных животных, так и в суспензиях из различных органов и опухолей.

Украинскими учеными представлены результаты теоретического и экспериментального сравнения праймеров, которые используют в различных лабораториях для выявления вируса лейкоза крупного рогатого скота посредством ПЦР. Показано, что праймеры BLV 3/ BLV 4 (на env - ген), разработанные в Институте экспериментальной и клинической ветеринарной медицины УААН, обладают всеми характеристиками, необходимыми для высококачественных праймеров. Помимо выявления провируса и вируса в крови животных, ПЦР - технологии позволяют проводить генотипирование вируса ЛКРС. Установлено, что существуют особые варианты вируса, при инфицировании которыми животные остаются серонегативными в течение всего периода инфицирования, и даже в случае прогрессии заболевания. Генотипирование вируса в этом случае производят с помощью ПЦР - Hae III ПДРФ анализа участка гена env.

Важной областью применения ПЦР является исследование импортного скота, находящегося в карантине, с целью предотвращения завоза ВЛКРС из одной страны в другую. Существенно ограничивает применение метода ПЦР - его высокая стоимость и трудоемкость, поэтому его целесообразно использовать только для исследования высокоценных животных. Кроме указанных выше случаев, ПЦР можно рекомендовать для контроля вакцин из цельной крови на специфическую стерильность.

Преимущества ДНК - технологий в ранней диагностике лейкоза крупного рогатого скота

Разработанная и широко применяемая в ветеринарных лабораториях страны реакция иммунодиффузии в геле агара (РИД) с использованием антигена ВЛ в настоящее время остается основным диагностическим методом, по результатам которого проводят оздоровительные и профилактические мероприятия в неблагополучных по лейкозу хозяйствах. В действующих в настоящее время "Правилах по профилактике и борьбе с лейкозом КРС" приоритет отдается именно серологическим исследованиям сыворотки крови. По их результатам судят об инфицированности животных вирусом лейкоза. В зависимости от этого определяют мероприятия по оздоровлению. Однако, как и любой диагностический метод, РИД не лишен недостатков.

Так, наличие у лейкоза латентной стадии усложняет диагностику заболевания. Экспериментально установлено, что после заражения скрытый период инфекции продолжается от 2 недель до нескольких месяцев, по этому постепенно выводя из стада РИД-позитивных животных, теоретически возможно добиваться полного оздоровления хозяйства от лейкоза. Тем не менее, в оздоровленных стадах, не имевших контактов с другими, через несколько месяцев или даже лет выделяют животных с антителами к ВЛКРС. Это можно объяснить характерным для лейкоза явлением иммунологической толерантности, когда наблюдают вирусоносительство без антителообразования. Иммунологическая толерантность - это частичная или полная утрата способности организма вступать в иммунную реакцию со специфическими антигеном. При лейкозе КРС состояние толерантности может развиваться в случае внутриутробного заражения плода инфицированными лимфоцитами матери в период до проявления иммунной компетенции, то есть в первые 3 месяца развития эмбриона. У отдельных животных, например, у глубоко стельных коров, когда иммуноглобулины накапливаются в секрете молочной железы и в некоторых других случаях. Кроме того описаны случаи серонегативности при наличии сопутствующих инфекций, например вирусной диареи.

Метод не прямого иммуноферментного анализа (ИФА) обладает значительно большей чувствительностью, по сравнению с РИД, позволяет автоматизировать процесс, то есть уйти от субъективной оценки результатов реакции. Кроме того, с помощью ИФА можно обнаружить антитела к ВЛКРС в молоке и моче. Несмотря на очевидные достоинства, достоверность ИФА все же связана с иммунологическими реакциями, и поэтому не всегда адекватна.

В связи с изложенным выше, с целью ускорения полного оздоровления стад КРС от лейкоза, целесообразно использовать методы, выявляющие непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных. Перспективной в этом плане является полимеразная цепная реакция (ПЦР). Этот метод позволяет выявлять провирусную ДНК или вирусную РНК в образце крови животного.

Довольно часто выявляется несоответствие результатов ПЦР и РИД. ПЦР - позитивные особи выявляются среди РИД - отрицательных животных, а ПЦР - негативные - среди РИД - позитивных. Вполне вероятно, что, не смотря на очень высокую чувствительность ПЦР, в развитии лейкозного процесса бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. В таких случаях РИД оказывается более информативна. Поэтому имеет смысл "дочищать" ПЦР РИД - и ИФА - негативных животных: при таком комбинированном использовании диагностических методов гарантировано эффективное оздоровление стада. Обнадеживающие результаты получены В. В. Макаровым, Д. П. Гринишиным (2005), которым удалось доказать, что использование комбинированной РИД/ПЦР диагностики более чем в два раза ускоряет процесс оздоровления стада от лейкоза, в сравнении с использованием только исследований в РИД. Авторы отмечают, что при жесткой браковке животных, положительно реагирующих в РИД, "шлейф" РИД - позитивных особей продолжал выявляться до 9 - го исследования, а при совместном РИД\ПЦР - исследовании - до 4 - го.

Аннотация научной статьи по ветеринарным наукам, автор научной работы — Саушкин Николай Юрьевич, Самсонова Жанна Васильевна, Осипов Александр Павлович, Кондаков Сергей Эмильевич, Хаммадов Наиль Ильдарович

Проведено сравнение методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммуноферментного анализа (ИФА) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием сухих пятен крови, полученных на пористых мембранных носителях . Анализ образцов методом ПЦР в режиме реального времени проводили на нескольких диагностических тест-системах. Методом ПЦР было выявлено 19 положительных образцов, методом ИФА 20, при этом для 14 образцов результаты совпадали. 26 образцов были определены как положительные на лейкоз при совместном использовании методов ПЦР и ИФА, что составило 47% от общего числа исследованных проб. Результаты анализа сухих и нативных образцов практически полностью совпадали. Полученные результаты показали возможность использования метода пробоподготовки образцов цельной крови в виде сухих пятен на мембранах в качестве удобного и надежного способа получения сухих образцов биологических жидкостей с целью мониторинга стад на наличие инфекционных заболеваний, в частности лейкоза крупного рогатого скота.

Comparison of PCR and ELISA Methods for Detection of Bovine Leucosis in Dried Blood Spots

PCR and ELISA methods for detection of bovine leucosis in dried blood spots on porous membranes were compared. Dried samples were analyzed by real-time PCR using several diagnostic test-systems. 19 and 20 samples were detected as positive by PCR and ELISA , correspondently. 14 samples among them were positive in both methods. PCR and ELISA recovered 26 positive samples (47%) in total. The results of analysis of dried and native samples were in good agreement. Obtained results showed that whole blood sampling in a form of dried spots on membrane can be used as a convenient and reliable way for biological fluid sampling for bovine leucosis screening.

СРАВНЕНИЕ МЕТОДОВ ПЦР И ИФА ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ЛЕЙКОЗА КРУПНОГО РОГАТОГО СКОТА

С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ СУХИХ ПЯТЕН КРОВИ

1 12 12 12 Н.Ю. Саушкин *, Ж.В. Самсонова ' , А.П. Осипов ' , С.Э. Кондаков ' ,

Н.И. Хаммадов3, К.В. Усольцев3, Х.З. Макаев3, А.Н. Чернов3

Проведено сравнение методов полимеразной цепной реакции (ПЦР) и иммунофер-ментного анализа (ИФА) для диагностики лейкоза крупного рогатого скота с использованием сухих пятен крови, полученных на пористых мембранных носителях. Анализ образцов методом ПЦР в режиме реального времени проводили на нескольких диагностических тест-системах. Методом ПЦР было выявлено 19 положительных образцов, методом ИФА - 20, при этом для 14 образцов результаты совпадали. 26 образцов были определены как положительные на лейкоз при совместном использовании методов ПЦР и ИФА, что составило 47% от общего числа исследованных проб. Результаты анализа сухих и нативных образцов практически полностью совпадали. Полученные результаты показали возможность использования метода пробоподготовки образцов цельной крови в виде сухих пятен на мембранах в качестве удобного и надежного способа получения сухих образцов биологических жидкостей с целью мониторинга стад на наличие инфекционных заболеваний, в частности лейкоза крупного рогатого скота.

Ключевые слова: энзоотический лейкоз, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция, пористые мембранные носители, сухие пятна крови.

Технология сухих пятен крови (от англ. DBS -Dried Blood Spot) в последние годы получает все более широкое распространение в медицине и ветеринарии [1]. Для получения сухих пятен образец жидкой крови пациента по каплям наносят на специальную мембранную карточку из целлюлозного материала и высушивают. Полученный таким образом образец обладает высокой стабильностью при хранении и транспортировке даже при комнатной температуре, что дает возможность направлять сухие образцы биологических жидкостей в диагностическую лабораторию посредством курьерской или почтовой службы без использования холодовой цепи. Для проведения анализа из мембраны специальным устройством вырезают круг определенного диаметра, с которого элюируют содержащийся на этом участке высушенный образец. Далее в полученном растворе проводят выявление исследуемых веществ стандартными аналитическими методами. Нами был предложен новый формат пробоподготовки в виде сухих пятен на полосках мембраны из пористого стекловолоконного материала [2]. Данный формат был успешно применен для отбора, хранения и анализа сухих образцов молока методом иммуно-

ферментного анализа (ИФА) для количественного определения прогестерона в целях выявления нестельных особей [3], а также для определения провирусной ДНК вируса лейкоза методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с электрофорети-ческой детекцией [4]. В данной работе внимание уделялось определению вирусного лейкоза крупного рогатого скота (КРС) в сухих образцах крови, диагностику которого проводили с помощью как ПЦР в режиме реального времени, так и ИФА.

Лейкоз КРС - хроническая инфекционная ретро-вирусная болезнь, вызываемая РНК-содержащим вирусом семейства Retroviridae. Источником возбудителя болезни являются инфицированные вирусом лейкоза КРС животные на всех стадиях инфекционного процесса. Факторами передачи вируса являются кровь, слюна, молоко и другие биологические жидкости, содержащие лимфоидные клетки. В последние годы энзоотический лейкоз КРС занимает в РФ одно из ведущих мест в инфекционной патологии. На долю лейкоза КРС приходится более половины установленных случаев инфекционных заболеваний. Для борьбы с болезнью необходима своевременная диагностика и выбраковка зараженных лейкозом животных [5].

В основе диагностики энзоотического лейкоза КРС лежат серологические методы, такие как реакция иммунодиффузии в агарозном геле (РИД) и ИФА. Эти методы направлены на выявление специфических антител, вырабатываемых организмом зараженного животного в качестве иммунного ответа на чужеродный белок вируса-возбудителя. В отличие от метода РИД, который основан на визуальном детектировании преципитации ком -плексов антиген-антитело, метод ИФА обладает большей чувствительностью и специфичностью и позволяет получить результаты анализа в течение нескольких часов. Наличие провирусной ДНК, содержащейся в геноме зараженной клетки, определяют с помощью метода ПЦР. Применение этого метода позволяет выявлять зараженных животных среди серонегативных особей, т.е. среди тех, у ко -торых еще не успел выработаться иммунный ответ, а также у молодняка до 6 месяцев. Таким образом, комплексное использование двух методов анализа (ПЦР и ИФА) позволяет наиболее полно проводить мониторинг стад на наличие вирусных инфекций, таких как лейкоз КРС, и своевременно проводить оздоровительные мероприятия [6].

Цель данной работы - применение методов ПЦР и ИФА для определения лейкоза КРС в сухих образцах крови, полученных на пористых мембранных носителях, а также сравнение результатов определения провирусной ДНК вируса лейкоза КРС несколькими ПЦР тест-системами.

Материалы и методы

Отбор и подготовка сухих образцов крови.

Выявление провирусной ДНК вируса лейкоза КРС в сухих пятнах крови методом ПЦР в режиме реального времени. Для выделения нукле-

Результаты и обсуждение

Для эффективного выделения ДНК из проб крови, высушенных на мембранных носителях, необ-

ходимо было обеспечить наиболее полное элюи-рование образца, содержащего искомую ДНК, с полоски мембранного материала. Экспериментально было установлено, что время элюирова-ния сухой крови должно составлять не менее 20 мин с тщательным периодическим перемешиванием образца. С использованием праймеров экзогенного контроля было показано, что полученный после элюирования сухого образца раствор содержал в себе общую ДНК. Результаты ПЦР жидких и сухих образцов крови в режиме реального времени на наличие провирусной ДНК вируса лейкоза КРС, полученные с использованием тест-систем ПЦР-1 и ПЦР-3, представлены в табл. 1. ДНК выделяли методом спиртового осаждения. Обе системы показали практически идентичные результаты при анализе жидких образцов. В двух сухих образцах (№ 8 и № 22), в отличие от жидких, провирусная ДНК не была выявлена, причем образец № 8 оказался отрицательным в обеих системах. Это связано, вероятно, с малым количеством выделенной из сухих образцов ДНК, что может быть следствием недостаточного количества сухого образца, взятого для анализа. В эксперименте использовали 3 квадратных участка мембраны с образцом, что эквивалентно половине объема аликвоты жидкой крови (100 мкл).

Течение болезни таково, что число инфицированных лимфоидных клеток в крови зараженного животного индивидуально у каждой особи и сильно зависит от стадии протекания болезни. Так, например, вирус может поражать только внутренние органы и ткани, а количество клеток периферической крови, содержащих провирус-ную ДНК, может быть недостаточным для амплификации в аликвоте, используемой для выделения генетического материала. Для увеличения чувствительности метода следует использовать большее число участков мембраны на стадии элюирования сухого образцы и проводить анализ в нескольких повторах. Сравнение полученных в ПЦР результатов с результатами серологического исследования образцов методом ИФА показало, что 2 ПЦР-положительных образца оказались се-ронегативными, а 4 сероположительных - ПЦР-отрицательными. В первом случае результат является следствием прямого выявления поражающего фактора (провирусной ДНК) методом ПЦР, в отличие от косвенного серологического, который не может выявить антитела у животных на ранних стадиях инфицирования. Во втором случае расхождение результатов может быть следствием либо недостаточной чувствительности ПЦР при

выявлении провирусной ДНК в связи с ее малым содержанием в крови в определенные стадии болезни, либо ошибкой ИФА, давшего ложнопо-ложительные результаты. Ложноположительные результаты в ИФА могут быть следствием повышенного уровня антител либо у взрослых особей после вакцинации или отела, либо у молодняка зараженных коров (до шести месяцев), имеющих так называемый колосторальный иммунитет. Анализ этих образцов следует повторить спустя несколько месяцев с помощью ИФА и ПЦР, а подозрительных животных изолировать от общего стада.

В табл. 2 представлено сравнение результатов, полученных для жидких и сухих образцов с помощью систем ПЦР-1 и ПЦР-2 при амплификации ДНК, полученной двумя методами выделения. В двух сухих образцах (№ 2 и № 20) при использовании сорбентного метода выделения искомая ДНК не была обнаружена, а при выделении методом спиртового осаждения данные сухие образцы аналогично жидким были определены как положительные. Выделение генетического материала из сухих образцов с помощью сорбентных магнитных частиц оказалось менее эффективным, чем выделение ДНК методом спиртового осаждения. Во втором случае были выявлены дополнительно 4 положительных образца. Кроме того, время проведения стадий выделения ДНК по методике, основанной на спиртовом осаждении, значительно меньше, чем при сорбентном выделении, включающем большое число промывок сорбента. Каждая последующая промывка сорбента может приводить к потерям сорбированной на нем ДНК, что отразилось на конечных результатах. Как видно из табл. 2, результаты амплификации выделенной ДНК для разных ПЦР тест-систем в некоторых случаях расходятся, что, вероятно, связано с разным набором праймеров, используемых в этих системах. Подбор праймеров при создании тест-системы основывается на данных о последовательности нуклеотидов того или иного участка провирусной ДНК различных генотипов вируса и может быть направлен как на консервативные участки, так и на вариабельные. Выделяют 8 различных генотипов вируса лейкоза КРС, которые имеют выраженное географическое распространение [7]. Однако даже в пределах одного хозяйства могут наблюдаться несколько генотипов вируса, завезенных вместе с зараженными особями из других стран и регионов. Это усложняет создание универсального набора праймеров и приводит к появлению ложноотрицательных результатов при ПЦР анализе, снижая его эффективность.

Т а б л и ц а 1

Результаты анализа сухих и жидких образцов цельной крови КРС методом ПЦР (спиртовое

Лейкоз крупного рогатого скота – хроническая инфекционная болезнь опухолевой природы, которая протекает бессимптомно или проявляется лимфоцитозом и злокачественными образованиями в кроветворных и других органах и тканях.

Источником возбудителя инфекции является зараженный организм животного, представляющий собой среду обитания вируса лейкоза крупного рогатого скота (ВЛКРС). Только в организме животного отмечено сохранение, размножение и накопление этого вируса. Доказано, что местом локализации вируса является лимфоцит.

Передача ВЛКРС восприимчивому крупному рогатому скоту может осуществляться со всеми секретами и экскретами при попадании в них лимфоцитов зараженных вирусом.

Эпизоотический процесс лейкоза является сложным непрерывным процессом передачи ВЛКРС от зараженных к восприимчивым здоровым животным. Имеются два пути передачи вируса: вертикальный (внутриутробный) и горизонтальный (контактный). Заражение происходит обычно горизонтально, то есть в результате ввода здоровых животных в стадо, инфицированное ВЛКРС, и в здоровых стадах – путем ввода в них животных, зараженных вирусом лейкоза.

ВЛКРС может передаваться трансплацентарно с инфицированными лимфоцитами матери благодаря способности лимфоцитов мигрировать в межклеточном пространстве и таким образом преодолевать плацентарный барьер. По некоторым данным, до 20 % телят, зараженных вирусом ВЛКРС от матерей, могут рождаться инфицированными. Вирус лейкоза присутствует в молозиве и молоке инфицированных коров. Инокуляция такого молока или молозива телятам и овцам индуцирует у них инфекцию.

Индуцированная ВЛКРС инфекция характеризуется некоторыми особенностями. Возбудитель персистирует в организме пожизненно в виде провируса, интегрированного в геном лимфоцитов хозяина, при этом свободные зрелые вирионы или их антигены, как правило, отсутствуют. Постоянным признаком инфекции служит продукция специфических антител. Поэтому для диагностики широко применяют непрямые серологические методы исследования, такие, как реакцию диффузионной преципитации (РИД) и иммуноферментный анализ (ИФА).

В настоящее время программы оздоровления хозяйств от лейкоза построены на применении в качестве диагностики серологических методов (РИД и ИФА), предотвращение контакта животных, свободных от вируса лейкоза крупного рогатого скота, с зараженными животными и удаление последних от популяции.

Как показала практика, при таком подходе оздоровление затягивается на годы, так как невозможно выявить всех инфицированных животных, особенно на ранних стадиях заболевания, и изолировать их от здоровых.

Для ускорения полного оздоровления стад от лейкоза целесообразно совместно с РИД и непрямым ИФА использовать методы, выявляющие непосредственно вирус или провирус у инфицированных животных. Перспективной в этом направлении является полимеразная цепная реакция (ПЦР), позволяющая выявлять провирусную РНК в крови животного. Проанализировав литературные данные, расположили методы диагностики лейкоза в порядке возрастания чувствительности, точности и специфичности в следующем порядке: РИД, ИФА, ПЦР.

Несмотря на очень высокую чувствительность ПЦР, бывают такие периоды, когда уровень провирусной ДНК минимален. В таких случаях РИД оказывается более информативной. Поэтому имеет смысл методом ПЦР контролировать РИД- и ИФА-негативных особей. При таком комбинированном применении диагностических тестов можно быстро и эффективно оздоровить стадо. С помощью ПЦР выявляют непосредственно провирус, то есть результат анализа не зависит от возраста и состояния животного, поэтому ПЦР можно использовать для разделения телят на инфицированных и здоровых в возрасте от 15 дней до 5 месяцев (в этом возрасте применять РИД не имеет смысла).

Система РИД+ПЦР перспективна при лейкозе КРС, так как обладает рядом преимуществ перед РИД и позволяет с высокой достоверностью одномоментно выявлять максимальное количество инфицированных животных на самых ранних стадиях заболевания. Это существенно сокращает сроки оздоровительных противолейкозных мероприятий. Кроме того, ПЦР применима для обследования молодняка, начиная с 15-дневного возраста.

Процент инфицированных телят к 3-месячному возрасту, по данным ПЦР, практически соответствует проценту РИД-позитивных особей, но в более позднем возрасте (к 3 годам). По-видимому, это свидетельствует о том, что заражение животных происходит в раннем возрасте (трансплацентарно и до 3 месяцев), а первые иммунологические признаки болезни появляются после первой лактации. Таким образом, если в первые недели жизни методом ПЦР разделить телочек на носителей провируса и здоровых, то оздоровить хозяйство можно значительно быстрее.

Высокая чувствительность ИФА в отличие от РИД позволяет быстро и массово исследовать сыворотки крови. С помощью данного метода можно выявлять стада, в которых уровень инфицированности не превышает 1 %. Однако ИФА и РИД не способны дифференцировать материнские антитела у молодых животных от активных антител, продуцирующихся при вирусной инфекции.

Являясь самым чувствительным на сегодняшний день методом обнаружения инфекционных агентов ПЦР не требует иммунологического ответа на проникновение возбудителя в организм хозяина, что дает возможность следить за ранними стадиями развития инфекции. ПЦР позволят выявить фрагменты провирусной ДНК, встроенные в геном инфицированного животного или вирусную РНК, тем самым представляя собой прямой метод диагностики в отличие от непрямых РИД и ИФА.

Зараженных животных первично выявляют с помощью РИД. Одновременно всех телят с 15-дневного до 6-месячного возраста и дополнительно РИД-негативных животных исследуют с помощью ПЦР. Дальнейшее выявление зараженных животных старше 6-месячного возраста проводят методом РИД. А вновь поступающий молодняк, начиная с 15-дневного возраста – ПЦР. Все зараженные животные немедленно удаляются. Критерием благополучия оздоровляемого стада (в хозяйстве, на отделении, ферме, дворе) является получение двух подряд с интервалом в 3 месяца отрицательных результатов в РИД или ИФА всего поголовья старше 6-месячного возраста.

Согласно данных литературы и собственных наблюдений, для успешного оздоровления неблагополучных по лейкозу хозяйств необходимо осуществить следующие специальные и хозяйственные мероприятия.

1. Серологические исследования (РИД или ИФА) животных на лейкоз проводить с 6-месячного возраста с интервалом 3 месяца. Всех серопозитивных животных удалять из стада.

2. В целях повышения эффективности оздоровительных мероприятий и ускоренного выявления инфицированных животных, отрицательно реагирующих в РИД или ИФА, а также телят с 15-дневного возраста исследовать методом ПЦР.

3. При выращивании ремонтного и племенного молодняка первое серологическое исследование (РИД или ИФА) телок на лейкоз проводить в возрасте 6 месяцев, затем в 12-месячном возрасте, перед осеменением и в 6-7-месячной стельности. В ПЦР исследования молодняка начинать с 15-дневного возраста.

4. Стельных коров исследовать на лейкоз в РИД или ИФА за 30 дней до отела и/или через 30 дней после отела. Серопозитивных после отела переводят на откорм или в группу серопозитивных дойных коров. Полученных от них телят, положительных в ПЦР, переводят в группу откорма.

5. Быков-производителей исследовать на лейкоз в РИД или ИФА не менее 2 раз в год, с интервалом 3 месяца. Серопозитивных животных изолировать и передавать на откорм.

6. Новорожденных телят до 7-10-дневного возраста содержать в индивидуальных клетках в профилактории или в боксах вместе с коровами-матерями, а с 15-дневного возраста исследовать в ПЦР , положительно реагирующих передавать на откорм.

7. На заключительном этапе оздоровления (единичные случаи положительно реагирующих) телят, начиная с 15-дневного возраста и взрослых животных, ранее отрицательно реагирующих в РИД или ИФА, исследовать с применением ПЦР. Дальнейшие исследования проводить каждые три месяца.

8. Завозимый племенных животных в период карантина исследовать серологическим методом (РИД, ИФА) и однократно – ПЦР. При отрицательных результатах исследования животных вводить в общее стадо.

9. Животных, в сыворотке которых обнаружены специфические антитела (РИД, ИФА), подвергают гематологическим исследованиям.

10. Животных, показавших положительный результат при исследовании любым методом (РИД, ИФА, ПЦР), считать инфицированными лейкозом, повторные серологические исследования у них не проводятся. Таких животных следует изолировать от здоровых с последующей сдачей на убой или переводом в группу серопозитивных животных.

Критерий благополучия стада – получение двух подряд с интервалом в три месяца отрицательных результатов РИД или ИФА

Читайте также: